Este método fornece instruções passo a passo sobre como gerar organoides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos por diferenciação em endoderme definitivo, epitélio intestinal posterior e, finalmente, a transferência para condições de cultura 3D. Os resultados obtidos de organoides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos demonstram maior traduzibilidade do que os dados de culturas monocelulares, ao mesmo tempo em que são mais práticos do que organoides derivados de tecidos primários, que podem ser difíceis de manter em cultura a longo prazo. Após a geração de células intestinais humanas a partir de iPSCs diferenciadas, use uma pipeta sorológica de 5 mililitros para separar a monocamada celular de cada poço da placa de 6 poços.
E junte as células em um único tubo de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspender o pellet em meio de crescimento intestinal suplementado com fatores de crescimento. E adicionar o volume adequado de matriz extracelular de acordo com o número de poços a serem plaqueados.
Adicione 30 microlitros da suspensão celular ao centro do número apropriado de poços de uma placa de 48 poços. Garantir que o ECM seja colocado no centro do poço é muito importante para a estabilidade a longo prazo dessa amostra. Se a MEC tocar a parede do poço, ela pode entrar em colapso e as amostras podem ser perdidas.
Coloque a placa na incubadora de cultura celular por pelo menos 5 minutos. Quando a matriz extracelular estiver definida, adicionar 300 microlitros de meio de crescimento intestinal fresco suplementado com fatores de crescimento a cada poço e retornar a placa para a incubadora de cultura celular. Após 48 horas, utilizar microscópio de luz para verificar a formação de organoides nos poços.
Após 7 dias de cultura, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por DPBS gelado. Use uma pipeta sorológica de 5 mililitros para separar mecanicamente os organoides e a esfera da matriz extracelular da placa. Em seguida, agrupe os organoides em um único tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Coletar os organoides por centrifugação e aspirar o sobrenadante até o topo da camada visível da MEC. Ressuspenda o pellet em 15 mililitros de DPBS gelado e centrifugue as células novamente. Depois de aspirar o sobrenadante, como demonstrado, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de PBS gelado e use uma pipeta P200 para interromper manualmente os organoides intactos.
Confirme uma dissociação completa dos organoides. Girar os organoides dissociados e ressuspender no volume necessário da matriz extracelular antes de plaquear em uma placa fresca de 48 poços, como demonstrado. Em seguida, retorne a placa à incubadora por 5 minutos.
Após 5 minutos, retirar a placa da incubadora e adicionar o meio basal intestinal com fatores de crescimento e inibidor de ROCK. Troque de mídia a cada 2-4 dias. Para desencadear uma resposta inflamatória nos organoides intestinais, substituir o sobrenadante em cada poço da cultura organoide por 300 microlitros de meio basal recém-preparado suplementado com 40 nanogramas por mililitro de TNF alfa.
Em seguida, retornar a placa à incubadora de cultura celular por 48 horas para replicar um ambiente pró-inflamatório. A expressão gênica pode ser monitorada ao longo da diferenciação do IPSC humano usando marcadores de pluripotência que são altamente expressos no dia 0 e são rapidamente regulados para baixo durante o processo de diferenciação definitiva da endoderme. No dia 2 de diferenciação, os genes definitivos da endoderme devem começar a ser expressos, e a expressão deve atingir o pico no dia 3.
Durante a especificação do intestino posterior, a expressão de CDX2 e HNF4alfa deve ser induzida e aumentar com o tempo. 48 horas após a transferência da folha de células 2D, as folhas de células devem começar a se auto-organizar em estruturas esferoides 3D mais compactadas que são inicialmente pequenas, mas que aumentam gradualmente em tamanho e complexidade nos próximos 7-10 dias de cultura. Os organoides não devem ser passados até que tenham atingido uma morfologia esferoide organoide clara com epitélio óbvio e com o lúmen voltado para o centro da estrutura.
Quando as estruturas atingem esse estágio, a imunocitoquímica pode ser realizada para confirmar a expressão de marcadores intestinais, como vilina e CDX2. Para modelar a inflamação, o TNF alfa pode ser adicionado ao meio de cultura de tecido por 24-48 horas, o que tipicamente resulta na expressão de marcadores pró-inflamatórios em conjunto com a regulação negativa de marcadores epiteliais intestinais. Organoides intestinais pluripotentes derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos podem ser usados para descoberta de drogas, modelagem de doenças, edição de genes, estudo do microambiente tumoral e perfil transcriptômico, proteômico e epigenético de qualquer doença de interesse.
Este método pode ajudar muitos laboratórios a estabelecer organoides intestinais como um sistema modelo, fornecendo-lhes um método adicional para suas pesquisas.
