الهدف العام من الخلايا القائمة على بروتوكول هو عزل وثقافة الخلايا الصباغية البشرية، وتحسين أوجه القصور في الأساليب التقليدية. من الطريقة الجديدة يمكننا الحصول على كميات أكبر من خلايا الخلايا الصباغية الأولية في وقت قصير نسبيا، استنادا إلى المواد والمعدات. الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول هي حديثة للبالغين للأنسجة الجلدية التي يتم التخلص منها من جراحة الختان في المستشفى والتعامل معها وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث البشري بالمؤسسة رقم 2015120401، تاريخ 12 مايو 2015.
هذا هو عرض لجميع الكواشف المطلوبة. إعداد الأدوات والمواد العقيمة مقدما ووضع الأنسجة في طبق، وغسل الأنسجة مع 75٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية ومع غسل الحل العلاقات خمس دقائق كل يقطع الأنسجة إلى قطع مريحة وخردة الأنسجة مع شفرة الجراحية لإزالة طبقة الدهون. تسطيح الأنسجة مع الجانب الأدمة إلى أسفل إضافة 2.5 مليغرام لكل ملليلتر حل الفضاء للأنسجة الجلد.
غطّي القطع واحفظها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثاني، قشر قبالة البشرة من الأدمة ونقل على الفور البشرة إلى ثلاثة أطباق أخرى مع محلول الغسيل بدوره يغرق 0.05٪ التربسين في أنبوب المحتضنة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. إضافة وحدة تخزين متساوية من حل تحييد.
الماصات الحل صعودا وهبوطا لمدة 10 إلى 15 مرة. تمرير الحل من خلال مرشح الهريس 100 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق إزالة افرات إعادة تعليق البليت الخلية في 10 ملليلتر من المتوسطة تيفا.
إضافة 10 ميكرومتر من Y-27632. ضع علامة على المعلومات التي يكون هذا مجال الرؤية تحت المجهر. ويظهر الخلايا العائمة في احتضان المتوسطة في حاضنة 37 درجة مئوية.
هذا الرأي يظهر وجهة النظر في اليوم الثاني الخلايا بدأت في إرفاق الجزء السفلي من الطبق. والمنظر في اليوم التاسع يظهر ودائع واضحة من الخلايا الصباغية موجودة. إزالة يغسل supernatant الخلايا مع برنامج تلفزيوني إضافة مليمترين من 0.05٪ تريبسين احتضان الخلايا لمدة دقيقتين إضافة ملليلتر من حل تحييد.
أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant ببطء إعادة تعليق البليت الخلية مع 10 ملليمتر من المتوسطة تيفا. تغيير الوسط كل يومين.
هذه الصور تظهر وجهات النظر من مرور مخطط واحد تخطيطي بحيث يتم عرض الأسلوب الجديد والطريقة التقليدية في هذا الشكل. الإجراء لإعداد الأنسجة وهضم طريقة جديدة هو نفس الطريقة التقليدية. والفرق الوحيد هو أن الخلايا الدهنية المعزولة تلقيح في 10 دقيقة في المتوسطة تيفا لها مع وجود 10 ميكرومتر Y-27632.
بعد يومين استبدال وسائل الإعلام مع تيفا المتوسطة دون ملاحق في Y-27632. هذه اللوحة تظهر الصور التمثيلية للميلانويات التي أعدتها الطريقة التقليدية الصف العلوي والطريقة الجديدة في الصف السفلي في اليوم الثالث، اليوم السادس واليوم الثامن بعد التطعيم الأولي نسميه عدد الخلايا الصباغية في اليوم الثالث، اليوم السادس والثامن، وجدنا أن الطريقة الجديدة زادت من العائد الخلايا الصباغية بنحو خمس مرات. بعد ثمانية أيام العداد فعلنا العشرات وعد عدد الخلايا الصباغية في كل طبق واحد.
وأظهرت النتائج أن عدد الخلايا الصباغية المعزولة عن طريق طريقة جديدة هو أكثر بكثير من الطريقة التقليدية. Ki67 الدائمة تؤكد أن الخلايا الصباغية المعزولة عن طريق طريقة جديدة يمكن أن تتكاثر عادة أكثر أهمية حصلنا على وظيفة طبيعية من الخلايا الصباغية مع طريقة جديدة. لقد فحصنا نقاء الخلايا الصباغية بعد المرور الأولي من العزلة.
الممر واحدة ميلوانوسييت ل يقف ل MITF تعبير أيّ عبّر فقط في الخلايا الصباغية. ووجدنا ما يقرب من 100٪ كانت إيجابية ل MITF تشير إلى الخلايا الصباغية النقية التي تم الحصول عليها بعد مرور الأول. لاختبار الخلايا الصباغية المعزولة من الأساليب الجديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي.
تعاملنا مع الخلايا الصباغية مع قوة التبريد لأكثر من 90 في المختبر، ويلاحظ أن التبريد قوة يمكن أن تحفز تصبغ الخلايا الصباغية. إن أخذ هذه البيانات معًا يشير إلى أن الخلايا الصباغية المعزولة عن الطريقة الجديدة يمكن أن تنتج تصبغًا بشكل طبيعي. الصباغية الأولية، كما ذكر أعلاه الجلد وامتدت في الثقافة وقد استخدمت بسهولة للبحوث المختبرية والتطبيقات السريرية.
بعد أن ذكرت أن معرف Y-27632 في وسط الثقافة الأولية قبل يومين يمكن أن يزيد بشكل كبير من الخروج من الخلايا الصباغية. باختصار، لقد أنشأنا بنجاح طريقة جديدة بسيطة وعالية الكفاءة لعزل الخلايا الصباغية الأولية النقية من الأنسجة البالغة.
