L’objectif général du protocole basé sur les cellules est d’isoler et de culture les cellules des mélanocytes humains, améliorant ainsi les lacunes des méthodes conventionnelles. De la nouvelle méthode, nous pouvons obtenir de plus grandes quantités de cellules mélanocytes primaires dans un temps relativement court, basé sur des matériaux et des équipements. Les tissus humains utilisés dans ce protocole sont des adultes frais pour les tissus cutanés jetés de la chirurgie de circoncision à l’hôpital et manipulés conformément aux lignes directrices du numéro 2015120401 du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’institution, date du 12 mai 2015.
Il s’agit d’un affichage de tous les reagents requis. Préparer les instruments stériles et les matériaux à l’avance et mettre le tissu dans un plat, laver le tissu avec 75% d’éthanol pendant 30 secondes et avec des lavages solution attache cinq minutes chacun coupe le tissu en morceaux pratiques et gratter le tissu avec la lame chirurgicale pour enlever la couche de graisse. Aplatir les tissus avec le côté derme vers le bas ajouter 2,5 milligrammes par millilitre la solution spatiale pour les tissus de la peau.
Couvrir et conserver les morceaux à quatre degrés centigrades pendant la nuit. Le deuxième jour, décoller l’épiderme du derme et transférer immédiatement l’épiderme dans trois autres plats avec solution de lavage à son tour submerge 0,05% trypsine dans le tube incubé pendant 30 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés centigrades. Ajoutez un volume égal de la solution de neutralisation.
Pipettes la solution de haut en bas pour 10 à 15 fois. Passez la solution à travers un filtre à purée de 100 micromètres. centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes enlever le supernatant re-suspendre la palette cellulaire en 10 millilitres de tiva moyen.
Ajouter 10 micromètres de Y-27632. Marquez l’information c’est le champ de vision sous le microscope. Il montre des cellules flottant dans le milieu d’incubation dans un incubateur centigrade de 37 degrés.
Cette vue montre la vue le deuxième jour où les cellules ont commencé à fixer le fond du plat. Et la vue du neuvième jour montre des dépôts évidents de mélanocytes existent. Retirer le supernatant laver les cellules avec PBS ajouter deux millimètres de 0,05% trypsine incuber les cellules pendant deux minutes ajouter deux millilitres de la solution de neutralisation.
centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes. Retirer le supernatant lentement re-suspendre la palette cellulaire avec 10 millimètres de milieu tiva. Changez le milieu tous les deux jours.
Ces images montrent les vues du passage d’un diagramme schématique de sorte que la nouvelle méthode et la méthode conventionnelle sont présentées dans cette figure. La procédure de préparation des tissus et la digestion de la nouvelle méthode est la même que la méthode conventionnelle. La seule différence est que les cellules adipeuses isolées inoculées en 10 minutes dans son milieu tiva avec la présence de 10 micromètres Y-27632.
Après deux jours remplacer les médias par tiva moyen sans suppléments à Y-27632. Ce panneau montre des images représentatives des mélanocytes préparés par la ligne supérieure conventionnelle de méthode et par la nouvelle ligne inférieure de méthode au jour trois, sixième jour et jour huit après l’inoculation initiale nous appelons le nombre de mélanocytes au jour trois, sixième et huit, nous avons constaté que la nouvelle méthode a augmenté le rendement des mélanocytes d’environ cinq fois. Après huit jours compteur, nous avons fait douzaine et compter le nombre de mélanocytes dans chaque plat unique.
Les résultats ont montré que le nombre de mélanocytes isolés par une nouvelle méthode est beaucoup plus que la méthode conventionnelle. Ki67 debout confirmer que les mélanocytes isolés par une nouvelle méthode peut normalement proliférer plus important encore, nous avons obtenu la fonction normale des mélanocytes avec la nouvelle méthode. Nous avons vérifié la pureté des mélanocytes après le passage initial de l’isolement.
Le passage un mélanocytes pour le stand pour l’expression de MITF qui s’est exprimé seulement dans les mélanocytes. Et nous avons trouvé près de 100% cellules étaient positives pour MITF indiquant les mélanocytes purs obtenus après le premier passage. Tester les mélanocytes isolés des nouvelles méthodes peut fonctionner normalement.
Nous avons traité les mélanocytes avec refroidissement de force pendant plus de 90 in vitro et observons que le refroidissement de force peut induire la pigmentation des mélanocytes. La prise de ces données ensemble suggère que les mélanocytes isolés de la nouvelle méthode peuvent normalement produire la pigmentation. Les mélanocytes primaires, tels qu’énoncés ci-dessus de la peau et étendus en culture, ont été facilement utilisés pour la recherche en laboratoire et les applications cliniques.
Après avoir signalé que ID Y-27632 dans le milieu de culture initial avant deux jours peut augmenter considérablement l’out des mélanocytes. En résumé, nous avons réussi à établir une nouvelle méthode simple et très efficace pour isoler les mélanocytes primaires purs des tissus adultes.
