O objetivo geral do protocolo baseado em células é isolar e cultivar células de melanócitos humanos, melhorando as deficiências dos métodos convencionais. A partir do novo método podemos obter maiores quantidades de células melanócitos primárias em um tempo relativamente curto, com base em materiais e equipamentos. Os tecidos humanos utilizados neste protocolo são adultos frescos para tecidos de pele descartados da cirurgia de circuncisão no hospital e manuseados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Instituição número 2015120401, data de 12 de maio de 2015.
Esta é uma exibição de todos os reagentes necessários. Prepare instrumentos e materiais estéreis com antecedência e coloque o tecido em um prato, lave o tecido com 75% de etanol por 30 segundos e com as amarras da solução de lavagem de cinco minutos cada um corta o tecido em pedaços convenientes e raspa o tecido com lâmina cirúrgica para remover a camada de gordura. Achate os tecidos com o lado de dermis para baixo adicione 2,5 miligramas por mililitro a solução espacial para os tecidos da pele.
Cubra e armazene as peças a quatro graus centígrados durante a noite. No segundo dia, retire a epiderme da derme e transfira imediatamente a epiderme em outros três pratos com solução de lavagem, por sua vez, submerge 0,05% de trippsina no tubo incubado por 30 minutos em um banho de água a 37 graus centígrados. Adicione um volume igual da solução de neutralização.
Pipeta a solução para cima e para baixo por 10 a 15 vezes. Passe a solução através de um filtro de massa de 100 micrômetros. centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos remova a re-suspensão do pallet celular em 10 mililitros de meio tiva.
Adicione 10 micrômetros de Y-27632. Marque a informação que este é o campo de visão sob o microscópio. Mostra células flutuando no meio incubado em uma incubadora centígrada de 37 graus.
Esta vista mostra a vista no segundo dia as células começaram a anexar a parte inferior do prato. E a visão do nono dia mostra que existem depósitos óbvios de melanócitos. Remova a lavagem supernaca das células com PBS adicione dois milímetros de 0,05% de trippsina incubar as células por dois minutos adicione dois mililitros da solução de neutralização.
centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos. Remova lentamente o supernatante para suspender lentamente a pálete celular com 10 milímetros de meio tivo. Troque o meio a cada dois dias.
Estas imagens mostram as visões da passagem um diagrama esquemático para que o novo método e o método convencional sejam apresentados nesta figura. O procedimento para preparação tecidual e digestão de novo método é o mesmo do método convencional. A única diferença é que as células de gordura isoladas inocularam em 10 minutos em seu meio tivo com a presença de 10 micrômetros Y-27632.
Após dois dias substitua a mídia por tiva medium sem suplementos em Y-27632. Este painel mostra imagens representativas de melanócitos preparados pela linha superior do método convencional e pela nova linha inferior do método no terceiro dia, dia seis e oitavo após a inoculação inicial que chamamos de número de melanócitos no terceiro dia, dia seis e oito, descobrimos que o novo método aumentou o rendimento dos melanócitos em cerca de cinco vezes. Depois de oito dias contra fizemos dúzia e contamos o número de melanócitos em cada prato.
Os resultados mostraram que o número de melanócitos isolados pelo novo método é muito maior do que o método convencional. Ki67 em pé confirmam que os melanócitos isolados pelo novo método podem normalmente proliferar mais importante, obtivemos função normal dos melanócitos com o novo método. Verificamos a pureza dos melanócitos após a passagem inicial do isolamento.
A passagem um melanócitos para defender a expressão MITF que se expressava apenas em melanócitos. E descobrimos que quase 100% das células eram positivas para o MITF indicando melanócitos puros obtidos após a primeira passagem. Para testar melanócitos isolados dos novos métodos pode funcionar normalmente.
Tratamos melanócitos com resfriamento de força para mais de 90 in vitro e observamos que o resfriamento de força pode induzir a pigmentação de melanócitos. A coleta desses dados sugere que os melanócitos isolados do novo método normalmente podem produzir pigmentação. Os melanócitos primários, como indicado acima da pele e estendidos na cultura têm sido facilmente utilizados para pesquisas laboratoriais e aplicações clínicas.
Tendo relatado que o ID Y-27632 no meio de cultura inicial antes de dois dias pode aumentar drasticamente a saída dos melanócitos. Em resumo, estabelecemos com sucesso um novo método simples e altamente eficiente para isolar melanócitos primários puros de tecidos adultos.
