Hücre tabanlı protokolün genel amacı, insan melanosit hücrelerini izole etmek ve kültüretmek, geleneksel yöntemlerin eksikliklerini iyileştirmektir. Yeni yöntemden, malzeme ve ekipmanlara dayalı olarak, nispeten kısa bir sürede daha büyük miktarlarda birincil melanosit hücresi elde edebiliriz. Bu protokolde kullanılan insan dokuları, hastanede sünnet ameliyatından atılan deri dokuları için taze erişkin olup, Kurumun 12 Mayıs 2015 tarih ve 2015120401 sayılı İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'nun yönergelerine göre işlenmiştir.
Bu, gerekli tüm reaktiflerin bir göstergesidir. Önceden steril aletleri ve malzemeleri hazırlamak ve bir çanak içine doku ayarlamak, 30 saniye boyunca% 75 etanol ile doku yıkama ve yıkama çözeltisi ile beş dakika her uygun parçalar halinde doku keser ve yağ tabakası kaldırmak için cerrahi bıçak ile doku hurda. Dermis tarafı ile dokuları düzleştirmek mililitre başına 2,5 miligram deri dokularına uzay çözümü ekleyin.
Kapak ve dört derece santigrat bir gecede parçaları saklayın. İkinci gün, dermis epidermisini soyup hemen yıkama solüsyonu ile birlikte üç tabak atarım ve tüpteki %0.05 tripsin inkişaf edin ve 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatın. Nötralizasyon çözeltisinin eşit hacimli ekleyin.
Pipetler çözeltiyi 10-15 kez yukarı ve aşağı sarar. Çözeltiyi 100 mikrometrelik püre filtresinden geçirin. beş dakika için 200 kez g santrifüj tiva orta 10 mililitre hücre paleti yeniden askıya supernatant kaldırın.
Y-27632 10 mikrometre ekleyin. Bu mikroskop altında görüş alanı bu bilgileri işaretleyin. 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesinde orta kuluçkada yüzen hücreleri gösteriyor.
Bu görünüm, hücrelerin yemeğin altına takmaya başladığı ikinci gündeki görünümü gösterir. Ve dokuzuncu günkü manzara melanosittortularının varlığını gösteriyor. PBS ile süpernatant yıkama hücreleri çıkarın iki dakika boyunca hücreleri inkübün% 0.05 tripsin iki milimetre ekleyin nötralizasyon çözeltisi iki mililitre ekleyin.
beş dakika için 200 kez g santrifüj. Süpernatant yavaş yavaş tiva orta 10 milimetre ile hücre paletyeniden askıya çıkarın. Orta yı iki günde bir değiştirin.
Bu resimler, yeni yöntem ve geleneksel yöntem bu şekilde sunulan böylece pasaj bir şematik diyagram görüşlerini göstermektedir. Doku hazırlama ve yeni yöntemin sindirimi için prosedür geleneksel yöntem aynıdır. Tek fark, izole yağ hücrelerinin 10 mikrometre Y-27632 varlığı ile tiva ortamda 10 dakikada aşılanmış olmasıdır.
İki gün sonra Y-27632 takviyeleri olmadan tiva orta ile medya değiştirin. Bu panel, geleneksel yöntem üst sıra tarafından hazırlanan melanositlerin temsili görüntülerini gösterir ve yeni yöntemle üçüncü gün, altıncı gün ve sekizinci gün ilk aşılamadan sonra, üçüncü, altıncı ve sekizinci gün melanosit sayısını adlandırdığımız yeni yöntemle melanosit lerin verimini yaklaşık beş kat artırdığını bulduk. Sekiz gün sayaç sonra düzine yaptım ve her bir çanak melanosit sayısını saymak.
Sonuçlar, yeni yöntemle izole edilen melanosit sayısının geleneksel yöntemden çok daha fazla olduğunu göstermiştir. Ki67 ayakta yeni yöntemle izole melanositnormalde daha da önemlisi biz yeni yöntem ile melanosit normal fonksiyonu elde çoğalabilir onaylamak. Tecritten ilk geçişten sonra melanositlerin saflığını kontrol ettik.
Pasaj sadece melanosit ifade MITF ifade için bir melanositler. Ve mitf için yaklaşık %100 hücrelerin pozitif olduğunu bulduk. Yeni yöntemlerden izole melanositleri test etmek için normal çalışabilir.
Melanositleri 90'Dan fazla in vitro için kuvvet soğutma ile tedavi ettik ve kuvvet soğutmasının melanositlerin pigmentasyonunu tetiklediğini gözlemledik. Bu verileri bir araya getirmek, yeni yöntemden izole edilen melanositlerin normalde pigmentasyon üretebileceğini düşündürmektedir. Birincil melanositler, deri üzerinde belirtildiği gibi ve kültür genişletilmiş kolayca laboratuvar araştırmaları ve klinik uygulamalar için kullanılmıştır.
Id Y-27632'nin iki gün önce ilk kültür ortamına girerek melanositlerin dışarısını önemli ölçüde artırabileceğini bildirdikten sonra. Özetle, saf primer melanositleri yetişkin dokularından izole etmek için yeni ve son derece verimli yeni bir yöntem oluşturduk.
