El objetivo general del protocolo basado en células es aislar y cultivar células de melanocitos humanos, mejorando las deficiencias de los métodos convencionales. A partir del nuevo método podemos obtener mayores cantidades de células de melanocitos primarios en un tiempo relativamente corto, basado en materiales y equipos. Los tejidos humanos utilizados en este protocolo son adultos frescos para los tejidos de la piel desechados de la cirugía de circuncisión en el hospital y manejados de acuerdo con las directrices del Comité de ética de la investigación humana número 2015120401 de la Institución, fecha 12 de mayo de 2015.
Esta es una visualización de todos los reactivos necesarios. Preparar instrumentos y materiales estériles con antelación y colocar el tejido en un plato, lavar el tejido con 75%etanol durante 30 segundos y con lavados solución ata cinco minutos cada uno corta el tejido en piezas convenientes y raspar el tejido con cuchilla quirúrgica para eliminar la capa de grasa. Aplanar los tejidos con el lado de la dermis hacia abajo añadir 2,5 miligramos por mililitro la solución espacial a los tejidos de la piel.
Cubra y almacene las piezas a cuatro grados centígrados durante la noche. En el segundo día, pelar la epidermis de la dermis e inmediatamente transferir la epidermis a otros tres platos con solución de lavado a su vez sumerge 0.05% tripsina en el tubo incubado durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Agregue un volumen igual de la solución de neutralización.
Pipeta la solución hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces. Pase la solución a través de un filtro de puré de 100 micrómetros. centrífuga a 200 veces g durante cinco minutos retire el sobrenadante re-suspender el palé celular en 10 mililitros de medio tiva.
Añadir 10 micrómetros de Y-27632. Marque la información que este es el campo de visión bajo el microscopio. Muestra células flotando en la incubadora media en una incubadora de 37 grados centígrados.
Esta vista muestra la vista en el segundo día que las celdas han comenzado a adjuntar la parte inferior del plato. Y la vista en el día nueve muestra que existen depósitos obvios de melanocitos. Retire el sobrenadante lavar las células con PBS añadir dos milímetros de 0.05%trypsin incubar las células durante dos minutos añadir dos mililitros de la solución de neutralización.
centrífuga a 200 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante re-suspender lentamente el palé celular con 10 milímetros de medio tiva. Cambie el medio cada dos días.
Estas imágenes muestran las vistas del pasaje de un diagrama esquemático por lo que el nuevo método y el método convencional se presentan en esta figura. El procedimiento para la preparación de tejidos y la digestión del nuevo método es el mismo que el método convencional. La única diferencia es que las células grasas aisladas se inocularon en 10 minutos en su medio tiva con la presencia de 10 micrómetros Y-27632.
Después de dos días reemplazar los medios de comunicación con medio tiva sin suplementos en Y-27632. Este panel muestra imágenes representativas de melanocitos preparadas por el método convencional fila superior y por el nuevo método fila inferior en el día tres, día seis y día ocho después de la inoculación inicial llamamos al número de melanocitos en el día tres, día seis y ocho, encontramos que el nuevo método aumentó el rendimiento de los melanocitos en unas cinco veces. Después de ocho días de contraataque hicimos docenas y contamos el número de melanocitos en cada plato.
Los resultados mostraron que el número de melanocitos aislados por el nuevo método es mucho más que el método convencional. Ki67 de pie confirman que los melanocitos aislados por un nuevo método normalmente pueden proliferar más importantemente que obtuvimos la función normal de los melanocitos con el nuevo método. Comprobamos la pureza de los melanocitos después del paso inicial del aislamiento.
El pasaje que uno melanocitos para representa la expresión MITF que se expresa sólo en melanocitos. Y encontramos que casi 100% de las células eran positivas para MITF indicando melanocitos puros obtenidos después del primer pasaje. Para probar los melanocitos aislados de los nuevos métodos puede funcionar normalmente.
Tratamos los melanocitos con enfriamiento por fuerza durante más de 90 in vitro y observamos que el enfriamiento de la fuerza puede inducir la pigmentación de los melanocitos. Tomar estos datos juntos sugiere que los melanocitos aislados del nuevo método normalmente pueden producir pigmentación. Los melanocitos primarios, como se ha indicado anteriormente en la piel y extendidos en el cultivo se han utilizado fácilmente para la investigación de laboratorio y las aplicaciones clínicas.
Habiendo informado de que ID Y-27632 en el medio de cultivo inicial antes de dos días puede aumentar dramáticamente la salida de los melanocitos. En resumen, establecimos con éxito un nuevo método simple y altamente eficiente para aislar los melanocitos primarios puros de los tejidos adultos.
