Общая цель основанного на клетках протокола состоит в том, чтобы изолировать и культурировать клетки меланоцитов человека, улучшая недостатки обычных методов. От нового метода мы можем получить большее количество первичных клеток меланоцитов в относительно короткое время, на основе материалов и оборудования. Человеческие ткани, используемые в этом протоколе, являются свежими взрослыми для тканей кожи, выброшенных из хирургии обрезания в больнице и обработанных в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике человека Института no 2015120401, дата 12 мая 2015 года.
Это отображение всех необходимых реагентов. Подготовка стерильных инструментов и материалов заранее и установить ткани в блюдо, мыть ткани с 75%этанола в течение 30 секунд и с моет раствор связей пять минут каждый режет ткани на удобные куски и лома ткани с хирургическим лезвием, чтобы удалить жировой слой. Сгладить ткани с дермы стороной вниз добавить 2,5 миллиграмма на миллилитр пространства раствор для тканей кожи.
Обложка и хранить куски на четыре градуса по Цельсию на ночь. На второй день снимите эпидермис с дермы и сразу же перенесите эпидермис в еще три блюда с раствором для мытья, в свою очередь погружает 0,05%трипсина в трубку, инкубированную в течение 30 минут в водяной бане при 37 градусах по Цельсию. Добавьте равный объем решения для нейтрализации.
Пипетки раствор вверх и вниз в течение 10 до 15 раз. Перейдите решение через 100-метровый фильтр пюре. центрифуга при 200 раз г в течение пяти минут удаляет супернатант повторно приостанавливающий клеточный поддон в 10 миллилитров тивы среды.
Добавьте 10 микрометров Y-27632. Отметь информацию, что это поле зрения под микроскопом. Он показывает клетки, плавающие в среде инкубации в 37 градусов по Цельсию инкубатора.
Этот вид показывает вид на второй день клетки начали прикреплять нижней части блюда. И вид на девятый день показывает очевидные отложения меланоцитов существуют. Удалить супернатант мыть клетки с PBS добавить два миллиметра 0,05%трипсина инкубировать клетки в течение двух минут добавить два миллилитра нейтрализации решения.
центрифуга по 200 раз г в течение пяти минут. Удалите супернатант медленно повторно приостановить поддон клетки с 10 миллиметров tiva среды. Изменение среды каждые два дня.
На этих снимках приведены виды прохождения одной схематической диаграммы, поэтому новый метод и обычный метод представлены на этой рисунке. Процедура подготовки тканей и переваривания нового метода такая же, как и обычный метод. Разница лишь в том, что изолированные жировые клетки прививаться в течение 10 минут в ее тиве среды с наличием 10 микрометров Y-27632.
Через два дня заменить средства массовой информации с тивы среды без добавок на Y-27632. Эта панель показывает репрезентативные изображения меланоцитов, подготовленных обычным методом верхнего ряда и новым методом нижней строки на третий день, день шесть и восьмой день после первоначальной прививки мы называем число меланоцитов в день три, день шесть и восемь, мы обнаружили, что новый метод увеличил выход меланоцитов примерно в пять раз. После восьми дней счетчика мы сделали дюжину и подсчитать количество меланоцитов в каждом блюде.
Результаты показали, что количество меланоцитов, изолированных новым методом, гораздо больше, чем обычный метод. Ki67 стоя подтвердить, что меланоциты изолированы новым методом, как правило, размножаются более важно мы получили нормальную функцию меланоцитов с новым методом. Мы проверили чистоту меланоцитов после первоначального перехода из изоляции.
Проход одно меланоциты для стоят для выражения MITF которое выразило только в меланоцитах. И мы обнаружили, что почти 100% клеток были положительными для MITF, указывающими на чистые меланоциты, полученные после первого прохода. Для тестирования меланоцитов, изолированных от новых методов может нормально функционировать.
Мы обработали меланоциты силовым охлаждением более 90 в пробирке и заметили, что силовое охлаждение может вызвать пигментацию меланоцитов. Принимая эти данные вместе свидетельствует о том, что меланоциты изолированы от нового метода, как правило, может производить пигментацию. Первичные меланоциты, как указано выше кожи и расширены в культуре были легко использованы для лабораторных исследований и клинических применений.
Узнав, что ID Y-27632 в начальной среде культуры до двух дней может значительно увеличивает из меланоцитов. Таким образом, мы успешно создали новый простой и высокоэффективный метод изоляции чистых первичных меланоцитов от взрослых тканей.
