单细胞基因组应用的脂肪组织核分离

脂肪组织分解成亚型一直具有挑战性，因为脂肪细胞的脆弱性。该协议是开发通过有效隔离单核来克服这一点。该工作流程提供高度纯化的单核，并尽量减少核集料和细胞碎片。

这有利于数千个细胞的单细胞转录组分析。这种简单而健壮的协议可用于研究脂肪细胞在脂肪驻留细胞中的组织级组织。特别是开发表型、脂肪敲除和转基因小鼠。

此协议的可视化演示至关重要，因此在处理脂肪细胞方面没有太多经验的人可以复制和洞察脂肪异质性。从老鼠身上收集脂肪组织后，用纸巾拍干，放在干净的盘子里。将氯化钙加入消化液缓冲液，最终浓度为10 mM。

然后，在组织中加入一小体积，彻底切碎。将大约一半的准备消化缓冲液添加到切碎的组织。并使用血清移液器将样品转移到 50 mL 离心管中。

用剩余的缓冲液清洗盘子，并将其添加到50 mL管中。多次上下移位样品。然后，在 37 摄氏度下孵育 12 至 15 分钟，同时在 200 到 210 rpm 时摇晃。

孵育后，以1比1的体积比在样品中加入0.5%BSA，通过移液混合。在室温下以300 xg离心样品5分钟，以旋转下血管分数，将脂肪细胞分数留在顶部。通过 400 m 细胞过滤器将顶部分数过滤到 50 mL 管中。

然后，将过滤器倒置在管子上，然后用 0.5% BSA 将脂肪细胞转移到新管中，以反向清洗过滤器。使 BSA 的总量达到 10 至 15 mL，用血清移液器上下移液器移液。然后，在室温下以300 xg再次离心5分钟。

离心后，使用宽孔移液器尖端小心地将样品的顶层转移到冰上新的预冷却管顶部的 100 m 细胞过滤器上。用足够量的核制备缓冲液冲洗过滤器，然后丢弃。从这一步前进，保持一个样品在冰上，并迅速工作。

将样品留在冰上长达两分钟，间歇性地反转管子进行混合。然后，在1000 xg和4摄氏度的离心机10分钟。取出上流剂，将颗粒重新在1 mL的核制备缓冲液中。

将样品转移到干净的微离心管中，以避免接触旧管的墙壁。每个L RNase抑制剂添加0.6个单位并混合。然后，将样品离心10分钟。

取出上流液，重新暂停颗粒和1 mL的核洗涤缓冲液。使用可堆叠的 30 m 过滤器将样品双滤入清洁管中。然后，用约300升的核洗涤缓冲液清洗过滤器。

为了确认健康核的成功分离，用 trypan 染色样品的一小部分，并使用自动细胞计数器来评估平均死亡大小和死细胞百分比。用DAPI将样品染色在样品的一小部分中，并在显微镜下以20倍或更高的目标进行检测。核应该是圆的，有一个完好的核膜。

白色箭头表示没有完整膜的核。使用 FACS 清理核后，在 4 摄氏度下以 500 xg 离心 5 分钟，使样品浓缩。然后，在适当的核洗涤缓冲液中重建它。

实现每L浓度50至1500核，然后进行单细胞核RNA seq。为了去除细胞碎片和双子组，对二核核进行大小和粒度排序，以排除核聚合体和多头。最后对于 DAPI 积极事件。

这种分级策略可产生高度纯化的单核，其聚合物和碎屑最少。通过显微镜检查时，排序的核应该是圆形的，并且有一个完好的膜。使用实时 qRT-PCR 对新生的 Ucp1 mRNA（棕色脂肪细胞的标记基因）进行实时 qRT-PCR 的成功纯化。

铬平台从粘膜间棕色脂肪组织中确定了7500个核的转录组。通过 t-SNE 维数降低和 k-means 聚类，揭示了七种不同的细胞类型。所有聚类都表示Fabp4，泛腺细胞基因和子集表示高水平Ucp1 mRNA。

核分离，然后确认，虽然该协议可以受到几乎任何单细胞水平基因表达平台，包括铬从10倍基因组学。