La descomposición del tejido adiposo en subtipos ha sido un desafío debido a la naturaleza frágil del adipocitos. Este protocolo fue desarrollado para superar esto mediante el aislamiento efectivo de núcleos únicos. Este flujo de trabajo proporciona núcleos individuales altamente purificados con agregados nucleares minimizados y desechos celulares.
Esto es ventajoso para el perfilado de transcriptoma de una sola célula de miles de células. Este protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización a nivel de tejido de adipocitos en sus células residentes adiposas. Y en particular, para desarrollar fenotipado, noqueo y ratones transgénicos.
La demostración visual de este protocolo es fundamental para que las personas que no tienen mucha experiencia en el manejo de adipocitos puedan replicar y obtener información sobre la heterogeneidad adiposa. Después de recoger el tejido adiposo de los ratones, sécalo con una toalla de papel y colócalo en un plato limpio. Añadir cloruro de calcio al tampón de digestión a una concentración final de 10 mM.
Luego, agrega un pequeño volumen al tejido y pica completamente. Agregue aproximadamente la mitad de la cantidad de tampón de digestión preparado al tejido picado. Y utilice una pipeta serológica para transferir la muestra a un tubo centrífugo de 50 ml.
Lave el plato con el tampón restante y agréguelo al tubo de 50 ml. Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, incubar durante 12 a 15 minutos a 37 grados Celsius mientras se agita a 200 a 210 rpm.
Después de la incubación, añadir 0.5%BSA a la muestra en una proporción de volumen de 1 a 1 y mezclar bien por pipeteo. Centrifugar la muestra a 300 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente para girar hacia abajo la fracción stromovascular dejando la fracción de adipocitos en la parte superior. Filtre la fracción superior a través de un filtro de celda de 400 m en un tubo de 50 ml.
Luego, voltea el filtro boca abajo sobre el tubo y transfiere los adipocitos a un tubo nuevo usando 0.5%BSA para lavar el filtro a la inversa. Lleve el volumen total de la BSA a 10 a 15 ml y pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo con pipeta serológica. Luego, centrifugarlo de nuevo a 300 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de la centrifugación, utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir cuidadosamente la capa superior de la muestra a un filtro de celda de 100 m encima de un nuevo tubo pre-refrigerado sobre hielo. Enjuague el filtro con una cantidad suficiente de tampón de preparación de núcleos y, a continuación, deséchelo. De este paso adelante, mantenga una muestra sobre hielo y trabaje rápidamente.
Deje la muestra sobre hielo durante un máximo de dos minutos invirtiendo intermitentemente el tubo para mezclar. Luego, centrifugar a 1000 xg y 4 grados Celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de tampón de preparación de núcleos.
Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio para evitar tocar las paredes del tubo viejo. Añadir 0,6 unidades por inhibidor de L RNase y mezclarlo. Luego, centrifuga la muestra durante otros 10 minutos.
Retire el sobrenadante y resusppend un pellet y 1 ml de tampón de lavado de núcleos. Filtre dos veces la muestra en un tubo limpio utilizando filtros apilables de 30 m. A continuación, lave los filtros con unos 300 L de tampón de lavado de núcleos.
Para confirmar el aislamiento exitoso de núcleos sanos, manche una pequeña alícuota de la muestra con tripano y utilice un contador de células automatizado para evaluar el tamaño muerto promedio y el porcentaje de células muertas. Manchar en una pequeña alícuota de la muestra con DAPI y examinarla bajo un microscopio con un objetivo 20X o superior. Los núcleos deben ser redondos y tener una membrana nuclear intacta.
Las flechas blancas indican núcleos sin una membrana intacta. Después de limpiar los núcleos con FACS, concentre esta muestra centrifugando a 500 xg durante cinco minutos a 4 grados centígrados. A continuación, reconstituirlo en un volumen adecuado de tampón de lavado de núcleos.
Para lograr una concentración de 50 a 1500 núcleos por L y proceder con núcleos de una sola célula ARN seq. Para eliminar los desechos celulares y los dobletes, los núcleos de adipocitos se clasifican por tamaño y granularidad para excluir los agregados y multiplets nucleares. Y por último para eventos positivos de DAPI.
Esta estrategia de clasificación da como resultado núcleos de un solo núcleo altamente purificados con agregados y desechos mínimos. Cuando se inspecciona por microscopía, los núcleos clasificados deben ser redondos y tener una membrana intacta. La purificación exitosa de los núcleos también se puede realizar con qRT-PCR en tiempo real utilizando imprimaciones para el ARNm Naciente de Ucp1, un gen marcador para adipocitos marrones.
La plataforma de cromo determinó un transcriptoma de 7500 núcleos de tejido adipo marrón interscapular murino. Siete tipos de células diferentes se revelaron con la reducción de la dimensionalidad t-SNE y la agrupación en clústeres k-means. Todos los cúmulos expresaron Fabp4, un gen pan adipocitos y un subconjunto expresaron un alto nivel de ARNm Ucp1.
Los núcleos aislaron y luego confirmaron aunque este protocolo puede ser sometido a prácticamente cualquier plataforma de expresión génica de nivel de célula única, incluyendo Chromium de 10x Genomics.
