Adiposit kırılgan doğası nedeniyle alt tiplere yağ dokusunun ayrışması zor olmuştur. Bu protokol, tek çekirdeklerin etkin bir şekilde izole edilmesiyle bunun üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Bu iş akışı, en aza indirgenen nükleer agregalar ve hücresel enkaz ile yüksek oranda saflaştırılmış tek çekirdek sağlar.
Bu, binlerce hücrenin tek hücreli transkripsiyon profilini çıkarmada avantajlıdır. Bu basit ve sağlam protokol, yağ daki yerleşik hücrelerde adipositin doku düzeyinde ki organizasyonunu incelemek için uygulanabilir. Ve özellikle, geliştirme fenotipleme için, nakavt ve transgenik fareler yağ.
Bu protokolün görsel gösterimi, adiposit kullanımında fazla deneyimi olmayan kişilerin yağ heterojenliğini çoğaltabilmesi ve anlayabilmesi için önemlidir. Farelerden yağ dokusu topladıktan sonra, bir kağıt havlu ile kuru pat, ve temiz bir tabak yerleştirin. 10 mM'lik son konsantrasyona sindirim tamponuna kalsiyum klorür ekleyin.
Sonra, doku ya küçük bir hacim ekleyin ve iyice kıyma. Kıyma doku için hazırlanan sindirim tampon yaklaşık yarısı miktarını ekleyin. Ve numuneyi 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarmak için serolojik pipet kullanın.
Kalan tampon ile çanak yıkayın ve 50 mL tüp ekleyin. Pipet örnek yukarı ve aşağı birkaç kez. Daha sonra, 200-210 rpm sallayarak 37 santigrat derece 12 ila 15 dakika kuluçka.
Kuluçkadan sonra numuneye 1 ila 1 hacim oranında %0,5 BSA ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Stromovasküler fraksiyonu aşağı döndürmek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 xg'de numuneyi santrifüj edin ve adiposit fraksiyonu üstte bırakın. 400 m hücre filtresine rağmen üst kısmı 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin.
Daha sonra filtreyi tüpün üzerinde ters çevirin ve filtreyi ters yıkamak için %0,5 BSA kullanarak adipositleri yeni bir tüpe aktarın. BSA'nın toplam hacmini 10 ila 15 mL'ye getirin ve numuneyi serolojik pipetle yukarı ve aşağı inip çıkarın. Sonra, oda sıcaklığında beş dakika için 300 xg tekrar santrifüj.
Santrifüjden sonra, numunenin üst tabakasını buz üzerinde önceden soğutulmuş yeni bir tüpün üzerine 100 m hücre filtresine dikkatlice aktarmak için geniş bir pipet ucu kullanın. Filtreyi yeterli miktarda çekirdek hazırlama tamponuyla durulayın ve atın. Bu adımdan itibaren, buz üzerinde bir örnek tutmak ve hızlı bir şekilde çalışmak.
Tüpü karıştırmak için tüpü ters çevirerek iki dakikaya kadar buzun üzerinde bekletin. Sonra, 1000 xg ve 4 santigrat derece 10 dakika santrifüj. Supernatant çıkarın ve çekirdekleri hazırlık tampon 1 mL pelet resuspend.
Eski tüpün duvarlarına dokunmamak için numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. L RNase inhibitörü başına 0,6 birim ekleyin ve karıştırın. Sonra, başka bir 10 dakika için örnek santrifüj.
Supernatant çıkarın ve bir pelet ve çekirdekyıkama tampon 1 mL askıya. Istiflenebilir 30 m filtreler kullanarak numuneyi temiz bir tüpe çift filtreleyin. Daha sonra filtreleri yaklaşık 300 L çekirdekyıkama tamponu ile yıkayın.
Sağlıklı çekirdeklerin başarılı bir şekilde izole edilmesionaylamak için, trypan ile numunenin küçük bir aliquot leke ve ortalama ölü boyutu ve ölü hücrelerin yüzde değerlendirmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. DAPI ile numunenin küçük bir aliquot leke ve 20X hedefi veya daha yüksek bir mikroskop altında inceleyin. Çekirdekler yuvarlak olmalı ve sağlam bir nükleer membrana sahip olmalıdır.
Beyaz oklar bozulmamış bir membran olmadan çekirdekleri gösterir. FACS ile çekirdekleri temizledikten sonra, 4 santigrat derecede beş dakika 500 xg santrifüj ederek bu örnek konsantre. Daha sonra, çekirdekyıkama tampon uygun bir hacimde yeniden.
L konsantrasyonu başına 50 ila 1500 çekirdek elde etmek ve tek hücreli çekirdekleri RNA seq ile devam etmek. Hücresel enkaz ve doublets kaldırmak için, adiposit çekirdekleri boyutu ve parçalılık nükleer agregalar ve multiplets dışlamak için sıralanır. Ve son olarak DAPI olumlu olaylar için.
Bu derecelendirme stratejisi, en az agrega ve enkaz ile yüksek oranda saflaştırılmış tek çekirdekli neden. Mikroskopi ile incelendiğinde, sıralanmış çekirdekleri yuvarlak olmalı ve bozulmamış bir membrana sahip olmalıdır. Çekirdeklerin başarılı arınması, kahverengi adipositler için bir belirteç geni olan yeni doğan Ucp1 mRNA için astarlar kullanılarak gerçek zamanlı qRT-PCR ile de yapılabilir.
Krom platformu, murine interscapular kahverengi yağ dokusundan 7500 nükleustransomu belirledi. T-SNE boyutsallık azaltma ve k-ortalama kümeleme ile yedi farklı hücre tipi ortaya çıktı. Tüm kümeler Fabp4, bir pan adiposit geni ve bir alt kümesi ucp1 mRNA yüksek düzeyde ifade ifade ifade etti.
Çekirdekler izole edilmiş ve daha sonra bu protokol 10x Genomik Krom dahil olmak üzere hemen hemen herhangi bir tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu platformuna tabi olabilir rağmen doğruladı.
