La décomposition du tissu adipeux en sous-types a été difficile parce que la nature fragile de l’adipocyte. Ce protocole a été développé pour surmonter cela par l’isolement efficace des noyaux simples. Ce flux de travail fournit des noyaux simples hautement purifiés avec des agrégats nucléaires réduits au minimum et des débris cellulaires.
Ceci est avantageux pour le profilage transcriptome à cellule unique de milliers de cellules. Ce protocole simple et robuste peut être appliqué pour étudier l’organisation des adipocytes au niveau des tissus dans leurs cellules résidentes adipeuses. Et en particulier, au développement du phénotypage, de l’adipeux KO et des souris transgéniques.
La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle afin que les personnes qui n’ont pas beaucoup d’expérience dans la manipulation des adipocytes puissent reproduire et perspicacité dans l’hétérogénéité adipeuse. Après avoir recueilli le tissu adipeux des souris, tapotez-le à l’aide d’une serviette en papier et placez-le dans un plat propre. Ajouter le chlorure de calcium au tampon de digestion à une concentration finale de 10 mM.
Ensuite, ajouter un petit volume au tissu et bien le hacher. Ajouter environ la moitié de la quantité de tampon de digestion préparé au tissu haché. Et utilisez une pipette sérologique pour transférer l’échantillon dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
Laver le plat avec le tampon restant et l’ajouter au tube de 50 mL. Pipette l’échantillon de haut en bas à plusieurs reprises. Puis, l’incuber pendant 12 à 15 minutes à 37 degrés Celsius tout en secouant à 200 à 210 rpm.
Après l’incubation, ajouter 0,5 %BSA à l’échantillon à un rapport de volume de 1 à 1 et bien mélanger au pipetage. Centrifugeuse l’échantillon à 300 xg pendant cinq minutes à température ambiante pour faire tourner la fraction stromovasculaire laissant la fraction d’adipocyte sur le dessus. Filtrer la fraction supérieure par un filtre cellulaire de 400 m dans un tube de 50 mL.
Ensuite, retournez le filtre à l’envers sur le tube et transférez les adipocytes dans un nouveau tube en utilisant 0,5% BSA pour inverser le filtre. Porter le volume total de la BSA à 10 à 15 mL et pipette l’échantillon de haut en bas avec pipette sérologique. Puis, centrifugez-le à nouveau à 300 xg pendant cinq minutes à température ambiante.
Après centrifugation, utilisez une pointe de pipette à alésage large pour transférer soigneusement la couche supérieure de l’échantillon à un filtre cellulaire de 100 m au-dessus d’un nouveau tube pré-refroidi sur la glace. Rincez le filtre avec une quantité suffisante de tampon de préparation des noyaux, puis jetez-le. À partir de ce pas en avant, gardez un échantillon sur la glace et travaillez rapidement.
Laisser l’échantillon sur la glace jusqu’à deux minutes en inversant le tube par intermittence pour mélanger. Puis, centrifugeuse à 1000 xg et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer le supernatant et réutiliser la pastille dans 1 mL de tampon de préparation des noyaux.
Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse propre en prenant soin d’éviter de toucher les parois de l’ancien tube. Ajouter 0,6 unité par inhibiteur de la RNase L et mélanger. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant encore 10 minutes.
Retirer le supernatant et réutiliser une pastille et 1 mL de tampon de lavage des noyaux. Filtrez doublement l’échantillon dans un tube propre à l’aide de filtres empilables de 30 m. Ensuite, lavez les filtres avec environ 300 L de tampon de lavage de noyaux.
Pour confirmer l’isolement réussi des noyaux sains, tacher un petit aliquot de l’échantillon avec trypan et utiliser un compteur de cellules automatisé pour évaluer la taille morte moyenne et le pourcentage de cellules mortes. Taches dans un petit aliquot de l’échantillon avec DAPI et l’examiner au microscope avec un objectif de 20X ou plus. Les noyaux doivent être ronds et avoir une membrane nucléaire intacte.
Les flèches blanches indiquent les noyaux sans membrane intacte. Après avoir nettoyé les noyaux avec facs, concentrez cet échantillon en centrifugant à 500 xg pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, reconstituez-le dans un volume approprié de tampon de lavage des noyaux.
Pour atteindre une concentration de 50 à 1500 noyaux par L et procéder à un seq d’ARN de noyaux unicell cellules. Pour éliminer les débris cellulaires et les doublets, les noyaux d’adipocytes sont triés pour la taille et la granularité afin d’exclure les agrégats et les multipletes nucléaires. Et enfin pour les événements positifs DAPI.
Cette stratégie de classement se traduira par des noyaux simples hautement purifiés avec un minimum d’agrégats et de débris. Lorsqu’ils sont inspectés par microscopie, les noyaux triés doivent être ronds et avoir une membrane intacte. La purification réussie des noyaux peut également être exécutée avec qRT-PCR en temps réel utilisant des amorces pour l’ARNm Ucp1 naissant, un gène marqueur pour les adipocytes bruns.
La plate-forme de chrome a déterminé un transcriptome de 7500 noyaux du tissu adipeux brun interscapulaire murin. Sept types de cellules différents ont été révélés avec la réduction de la dimensionnalité t-SNE et le clustering k-means. Tous les amas ont exprimé Fabp4, un gène d’adipocyte de casserole et un sous-ensemble ont exprimé un niveau élevé d’ARNm Ucp1.
Noyaux isolés, puis confirmés bien que ce protocole peut être soumis à pratiquement n’importe quelle plate-forme d’expression génique de niveau unicell cellule, y compris le chrome de 10x génomique.
