아류형으로 지방 조직의 분해는 지방 세포의 깨지기 쉬운 특성 때문에 도전하고있다. 이 프로토콜은 단일 핵의 효과적인 격리에 의해 이를 극복하기 위해 개발되었다. 이 워크플로우는 핵 응집체및 세포 이물질을 최소화한 고도로 정제된 단일 핵을 제공합니다.
이것은 세포의 수천의 단세포 전사 프로파일링에 유리합니다. 이 간단하고 강력한 프로토콜은 그들의 지방 거주자 세포에 있는 지방 세포에 있는 지방 세포의 조직 수준 조직을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 그리고 특히, 페노티핑을 개발하기 위해 녹아웃 및 형질 전환 마우스를 지방으로 구성한다.
이 프로토콜의 시각적 데모는 비도체 처리경험이 많지 않은 사람들이 지방 이질성에 대해 복제하고 통찰력을 가질 수 있도록 매우 중요합니다. 쥐에서 지방 조직을 수집 한 후 종이 타월로 말리고 깨끗한 접시에 놓습니다. 염화칼슘을 소화 완충제에 추가하여 최종 농도10mM에 넣습니다.
그런 다음 조직에 작은 양을 추가하고 철저히 다진다. 다진 조직에 준비된 소화 버퍼의 약 절반을 추가합니다. 그리고 50mL 원심분리기 튜브로 샘플을 전송하기 위해 서학적 파이펫을 사용합니다.
나머지 버퍼로 접시를 씻고 50 mL 튜브에 추가합니다. 샘플을 여러 번 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 12~15분 동안 배양하고 200~210rpm에서 흔들리면 됩니다.
인큐베이션 후, 샘플에 0.5%BSA를 1 대 1 부피 비율로 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞는다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 300xg의 샘플을 원심분리하여 기질분획을 아래로 회전하여 위에 지방분획을 남깁니다. 400m 셀 필터를 50mL 튜브로 필터링하지만 상단 분획을 필터링합니다.
그런 다음 필터를 튜브 위로 거꾸로 뒤집어 서 0.5%BSA를 사용하여 새 튜브로 교포를 전달하여 필터를 역세척합니다. BSA의 총 부피를 10~15mL로 가져오고 시료를 서학적 파이펫으로 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 300 xg에서 원심 분리합니다.
원심분리 후, 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 샘플의 상단 층을 얼음 위에 있는 100m 셀 필터로 조심스럽게 전달합니다. 충분한 양의 핵 제제 버퍼로 필터를 헹구고 폐기합니다. 이 단계에서는 얼음 샘플을 보관하고 신속하게 작업하십시오.
샘플을 얼음 위에 최대 2분 간헐적으로 뒤집어 섞어 둡니다. 그런 다음 원심 분리기는 10분 동안 1000xg, 섭씨 4도에서 원심분리기를 합니다. 상체를 제거하고 핵 제제 완충제의 1mL에서 펠릿을 다시 분리한다.
샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 오래된 튜브의 벽에 닿지 않도록 돌봅니다. L RNase 억제제 당 0.6 단위를 추가하고 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 원심분리하여 10분 간 추가로 원심분리합니다.
상체를 제거하고 펠릿과 핵 세척 버퍼 1mL을 재연한다. 30m 필터를 사용하여 샘플을 깨끗한 튜브로 이중 필터링합니다. 이어서, 약 300L의 핵 세척 버퍼로 필터를 세척한다.
건강한 핵의 성공적인 분리를 확인하기 위해, trypan와 샘플의 작은 알리쿼트 얼룩과 죽은 세포의 평균 죽은 크기와 %를 평가하기 위해 자동화 된 세포 카운터를 사용합니다. DAPI를 가진 견본의 작은 알리쿼트에 얼룩및 20X 목표 이상으로 현미경의 밑에 그것을 검사합니다. 핵은 둥글고 그대로 핵막을 가져야 한다.
백색 화살표는 그대로 막없이 핵을 나타냅니다. FACS로 핵을 세척한 후, 이 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 500xg에서 원심분리하여 농축합니다. 그런 다음, 핵 세척 버퍼의 적절한 부피로 재구성한다.
L 농도당 50~1500개의 핵을 달성하고 단세포 핵 RNA 세크를 진행한다. 세포 이물질과 이중을 제거하기 위해, 비화 세포 핵은 핵 응집체및 다중을 제외하기 위해 크기와 세분성으로 분류됩니다. 그리고 마지막으로 DAPI 긍정적 인 이벤트에 대한.
이 채점 전략은 최소한의 응집체와 파편으로 고도로 정제된 단일 핵을 초래합니다. 현미경 검사법에 의해 검사될 때, 정렬된 핵은 둥글고 온전한 막을 가져야 합니다. 핵의 성공적인 정제는 또한 갈색 선포세포에 대한 마커 유전자인 초기 Ucp1 mRNA를 위한 프라이머를 사용하여 실시간 qRT-PCR으로 수행될 수 있다.
크롬 플랫폼은 뮤린 상호 엽 지방 조직에서 7500 핵의 전사를 결정했다. 7개의 상이한 세포 모형은 t-SNE 치수 감소 및 k-means 군집으로 드러났습니다. 모든 클러스터는 Fabp4, 팬 안도세포 유전자 및 하위 집합을 발현하여 높은 수준의 Ucp1 mRNA를 발현했다.
핵은 10x 유전체학으로부터 크롬을 포함하는 사실상 모든 단일 세포 수준의 유전자 발현 플랫폼을 실시할 수 있지만 핵을 분리하고 확인하였다.
