هذا هو وسيلة بسيطة وفعالة لعزل واستزراع بيريكيات الدماغ الأولية لدراسة إشارات الكالسيوم بين الخلايا. ثقافة الخلايا التي تم الحصول عليها هي مجموعة متجانسة تقريبًا من الـ(بيريكيت)، ومن السهل تحميل الـ pericytes لتصوير الكالسيوم. يجب أن توفر الطرق الموصوفة هنا للباحثين الآخرين في هذا المجال أدوات قوية لدراسة بيولوجيا البيريكس، وإشارات داخل الخلايا في بيريكيتس في المختبر.
تبدأ من خلال ذوبان قارورة واحدة من الشعيرات الدموية في حمام الماء 37 درجة مئوية. مرة واحدة قد ذاب الشعيرات الدموية، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي مع 30 ملليلتر من شركات DMEM، والطرد المركزي لهم لمدة خمس دقائق في 500 مرة G.Then، وإزالة المتوسطة من الأنبوب، وإعادة تعليق لوحة في 10 ملليلتر من شركات DMEM الطازجة. نقل التعليق إلى قارورة T-75 المغلفة، والسماح الشعيرات الدموية للتمسك أسفل لمدة أربع إلى ست ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية مزودة 10٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة، افحص القارورة تحت مجهر خفيف. وينبغي الآن أن تعلق كسور من الشعيرات الدموية إلى الجزء السفلي من القارورة. في اليوم الرابع بعد زرع الشعيرات الدموية، افحصها تحت المجهر للتأكد من أنها التقاء ما يقرب من 60 إلى 70٪.
التعرق المتوسطة، وغسل بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلترين من التربسين-EDTA المذاب، وترك القارورة في الحاضنة لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق، مع أخذ القارورة في كثير من الأحيان، ومراقبة مفرزة الخلايا مع المجهر. عندما تبدأ الخلايا البطانية في الدوس، اضغط بلطف على القارورة لفصلها.
عندما يكون لديك فصل الخلايا، إيقاف التبسينية عن طريق إضافة 10 ملليلتر من شركات DMEM إلى القارورة. تدفق قارورة عدة مرات مع المتوسطة، ويؤشّر تعليق الخلية البطانية، والتي يمكن استخدامها الآن لأغراض أخرى. إضافة 10 ملليلتر من شركات DMEM إلى القارورة، والتحقق من ذلك تحت المجهر الخفيف لضمان أن pericytes لا تزال موجودة ومتعلقة إلى أسفل.
ثم، ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة للسماح للثقافة الغنية بال pericyte أن تنمو. لزرع pericytes في لوحات 96-جيدا المغلفة، وفصل لهم كما هو موضح في مخطوطة النص. التعرق المتوسطة، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من شركات DMEM الطازجة.
عد الخلايا باستخدام غرفة العد، ثم حساب حجم التعليق التي ينبغي أن تضاف إلى كل بئر إلى البذور 10، 000 خلية في البئر. إضافة تعليق الخلية، ثم إضافة ما يكفي من شركات DMEM إلى الخلايا لتحقيق حجم إجمالي 200 ميكرولترس في البئر. عندما تكون جاهزة لتحميل البيريسيت مع صبغة مؤشر الكالسيوم فوا-2 AM، خذ لوحة 96-جيدا مع الخلايا من الحاضنة، ويتبخر المتوسطة من الآبار.
غسل الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت المقايسة، وإضافة 100 ميكرولترات من حل التحميل إلى كل بئر. التفاف لوحة مع tinfoil لتجنب تبييض الصور، واحتضان لمدة 45 دقيقة مع 30 دورة في الدقيقة تهتز في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، التعرق العازلة التحميل، وغسل الخلايا مع العازلة مُجرّد مرتين.
إضافة 100 ميكرولترات من جديد إلى المخزن المؤقت المقايسة، وترك الخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، تعيين درجة حرارة قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية، ونقل لوحة 96-جيدا مع الخلايا إلى وضع لوحة عينة، ثم وضع لوحة الكاشف مع ناهض في موقف لوحة الكاشف. ابدأ بقياس تحميل الخلايا لضمان التحميل المتساوي لـ Fura-2 AM في جميع الآبار، ثم قم بإجراء القياسات بطول موجي مفلور الإثارة عند 340 إلى 380 نانومتر، والطول الموجي للانبعاثات عند 510 نانومتر.
إضافة 50 ميكرولترات من ناهض، بسرعة 150 ميكرولتر في الثانية الواحدة، من لوحة الكاشف إلى كل بئر مع الخلايا. جبل زلة غطاء في غرفة الخلية، وتشديد عليه لتجنب تسرب. إضافة شركات DMEM وحجم محسوب من تعليق الخلية في كل غرفة، لحجم النهائي من 500 ميكرولترات.
احتضان غرف الخلية في 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ستة أيام، أو حتى التقاء. مرة واحدة في الخلايا التقاء، تأخذ غرف الخلية من الحاضنة، ويتبخر المتوسطة. اغسل الخلايا مرتين بمخزن الفحص المؤقت، وأضف 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل إلى كل غرفة، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
بعد الحضانة، وpirate العازلة التحميل، وغسل الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت المقايسة، ثم إضافة 500 ميكرولتررس من المخزن المؤقت مقولاة جديدة إلى كل غرفة واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة، للسماح انشقاق من استر صباحا. استبدل المخزن المؤقت بـ 500 ميكرولترات من مخزن المقايسة الطازج، وامضي في التصوير المباشر في مجهر confocal. قم بتركيب غرفة الخلية على خشبة المجهر برفق ممكن لتجنب اضطراب الخلايا.
تعيين الطول الموجي الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 515 نانومتر، واثنين من دقيقة اقتناء صورة متسلسلة مع خمس فترات ثانية، وx، ص حجم الصورة من 512 في 512 بكسل. إضافة 300 ميكرولترات من ATP 100 ملليمولار إلى غرفة الخلية، وبدء الحصول على الصورة. تم استخدام هذا البروتوكول لتنقية pericytes من الشعيرات الدموية المخ البقرية.
تم تصوير الخروج الخلوي من الشعيرات الدموية المصنفة على مدى تسعة أيام. كانت الشعيرات الدموية متصلة بالكامل بالقارورة في اليوم الأول ، وبحلول اليوم الثاني ، كانت النتدية البطانية مرئية. بعد أربعة أيام ، كان النمو الخلوي مميزًا ، وتمت إزالة الخلايا البطانية عن طريق التبسيني.
وكانت بقايا الشعيرات الدموية موجودة بعد التربسينسيس، ولكنها اختفت من القارورة في الأيام التالية. بعد إزالة طبقة البطانية، سمح لل pericytes أن تنمو حتى التقاء. في اليوم التاسع، وصلت الـ(بيريتس) إلى 80٪ تقريباً من الالتقاء، وشكلت جزراً.
إضافة ATP إلى pericytes تحميل فورا-2 أدى إلى زيادة في مستويات الكالسيوم السيتوسولي. حدثت الاستجابة مباشرة بعد إضافة ATP إلى الـ pericytes ، وانخفضت ببطء خلال الفترة الزمنية المقاسة. كما تم قياس استجابة الكالسيوم مع التصوير confocal في الوقت الحقيقي.
تم قياس الفلورس الأساسي ، ثم تمت إضافة ATP في 64 ثانية ، وكانت استجابة الكالسيوم داخل الخلايا واضحة. بعد فترة وجيزة، الكالسيوم الخلوي مجزأة في الخلايا، وانخفاض في منطقة الخلية كان مرئيا. وبحلول 300 ثانية، انخفضت منطقة الخلية بشكل كبير، وانخفضت الفلوريسنس تقريبا إلى مستويات خط الأساس.
وقد استخدمت هذه الطريقة للحصول على أول قياسات الكالسيوم داخل الخلايا من الشعيرات الشعيرية الأولية في الدماغ، مما يدل على أن يتم تحفيز بيريكيتس عن طريق ATP، وقادرة على العقد في المختبر.
