זוהי שיטה פשוטה ויעילה עבור בידוד ו culturing המוח הראשי pericytes לחקר איתות סידן בין תאיים. תרבות התאים המתקבלת היא אוכלוסייה כמעט הומוגנית של פריציטים, וזה פשוט לטעון את pericytes עבור הדמיה סידן. השיטות המתוארות כאן צריכות לספק לחוקרים אחרים בתחום כלים חזקים לחקר הביולוגיה של פריציטים, ואיתות תאי ב pericytes במבחנה.
התחל על ידי הפשרת בקבוקון אחד של נימים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר נימי יש להפשיר, להעביר אותם צינור צנטריפוגה עם 30 מיליליטר של DMEM comp, ו צנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 500 פעמים G.Then, להסיר את המדיום מהצינור, ולהשעות מחדש את הצבעים ב 10 מיליליטר של DMEM comp טרי. מעבירים את ההשעיה לבקבוק T-75 מצופה, ומאפשרים נימים לדבוק בתחתית במשך ארבע עד שש שעות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס המסופק עם 10% פחמן דו חמצני.
לאחר הדגירה, לבדוק את הבקבוקון תחת מיקרוסקופ אור. שברי נימים צריכים כעת להיות מחוברים לתחתית הבקבוק. ביום הרביעי לאחר זריעת נימים, לבדוק אותם מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי הם כ 60 עד 70% confluent.
שאפו את המדיום, ושטפו בעדינות את התאים עם PBS. מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין-EDTA מופשר, ומשאירים את הבקבוק באינקובטור למשך שעה עד שלוש דקות, מוציאים את הבקבוק לעתים קרובות, ומתבוננים בניתוק התא עם המיקרוסקופ. כאשר תאי ה אנדותל מתחילים לעגל למעלה, הקש בעדינות על הבקבוק כדי לנתק אותם.
כאשר התאים התנתקו, הפסק את ההתנתקות על-ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM comp לבקבוקון. לשטוף את הבקבוק כמה פעמים עם המדיום, ולשאיף את ההשעיה תא אנדותל, אשר כעת ניתן להשתמש בהם למטרות אחרות. הוסף 10 מיליליטר של DMEM comp לבקבוקון, ובדוק אותו תחת מיקרוסקופ האור כדי להבטיח כי pericytes עדיין נוכחים מחוברים לתחתית.
לאחר מכן, לשים את הבקבוק בחזרה לתוך החממה כדי לאפשר לתרבות מועשר pericyte לגדול. כדי לזרוע פריציטים לצלחות מצופות של 96 בארות, נתק אותן כמתואר בכתב היד של הטקסט. שאף את המדיום, דואג לא להפריע גלולת התא, ולהשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של DMEM טרי comp.
לספור את התאים באמצעות תא ספירה, ולאחר מכן לחשב את נפח ההשעיה כי יש להוסיף לכל באר כדי לזרוע 10, 000 תאים לגם. הוסף את ההשעיה התא, ולאחר מכן להוסיף מספיק DMEM comp לתאים כדי להשיג נפח כולל של 200 microliters ל הבאר. כאשר מוכנים לטעון את pericytes עם צבע מחוון סידן Fura-2 AM, לקחת את הצלחת 96 היטב עם התאים מתוך החממה, ולשאוב את המדיום מן בארות.
לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר בדיקה, ולהוסיף 100 microliters של פתרון טעינה לכל באר. עוטפים את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע הלבנת תמונות, ומדרבן אותה במשך 45 דקות עם רעידות של 30 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שאפו את מאגר הטעינה ושטפו את התאים עם מאגר ההטעיה פעמיים.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חיץ טרי למתן, ומשאירים את התאים דגירה במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להגדיר את הטמפרטורה של קורא הלוח ל 37 מעלות צלזיוס, ולהעביר את הלוח 96 היטב עם תאים למיקום צלחת מדגם, ולאחר מכן למקם את צלחת הריג'נט עם אגוניסט בעמדת צלחת reagent. התחל על ידי מדידת טעינה של התאים כדי להבטיח טעינה שווה של Fura-2 AM בכל הבארים, ולאחר מכן לבצע את המדידות עם אורך גל פלואורסצנטי בעירור ב 340 עד 380 ננומטר, ואת אורך גל הפליטה ב 510 ננומטר.
מוסיפים 50 מיקרוליטרים של אגוניסט, במהירות של 150 מיקרוליטרים לשנייה, מצלחת הריג'נט לכל באר עם תאים. הר להחליק כיסוי לתוך התא, ולהדק אותו כדי למנוע דליפות. הוסף comp DMEM ואת הנפח המחושב של מתלי תא לתוך כל תא, עבור נפח סופי של 500 microliters.
דגירה תאי התא ב 37 מעלות צלזיוס ו 10% פחמן דו חמצני במשך שישה ימים, או עד confluent. ברגע שהתאים מתבלבלים, מוציאים את תאי התא מהאינקובטור, ושואף את המדיום. לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ בדיקה, ולהוסיף 500 microliters של חיץ טעינה לכל תא, ולאחר מכן דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.
לאחר הדגירה, שאפו את מאגר הטעינה, ושטפו את התאים פעמיים עם חיץ בדיקה, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה טרי לכל תא ודגירה אותם עוד 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר מחשוף של אסתר AM. החלף את המאגר ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה טרי, והמשך בהדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקל. הר את תא התא על הבמה של המיקרוסקופ בעדינות רבה ככל האפשר, כדי למנוע הפרעה של התאים.
הגדר את אורך גל העירור על 488 ננומטר, פליטה ב 515 ננומטר, שתי דקות רכישת תמונה רציפה עם חמישה מרווחי זמן שניה, ו x, y גודל תמונה של 512 על 512 פיקסלים. הוסף 300 microliters של 100 מילימולר ATP לתא התא, וליזום רכישת תמונה. פרוטוקול זה שימש לטיהור פריציטים נימי מוח חזיר.
תפוגה תאית מהניבים הזרעים תדמית במשך תשעה ימים. נימי הבקבוק היו מחוברים במלואם לבקבוקון ביום הראשון, וביום השני, נבט אנדותל נראה לעין. לאחר ארבעה ימים, הגידול התאי היה ייחודי, ותאי ה אנדותל הוסרו באמצעות טריפסיניזציה.
שרידים של נימים היו נוכחים לאחר טריפסיניזציה, אבל נעלם מן הבקבוק בימים שלאחר מכן. לאחר הסרת שכבת ה אנדותל, pericytes הורשו לגדול עד הקונפדרציה. ביום התשיעי הגיעו ה־pericytes לכ־80%, ויצרו איים.
תוספת של ATP ל Pericytes טעון Fura-2 הביא לעלייה ברמות הסידן cytosolic. התגובה התרחשה מיד לאחר הוספת ATP ל pericytes, ונדחתה לאט לאורך פרק הזמן הנמדד. תגובת הסידן נמדדה גם בהדמיית קונפוקל בזמן אמת.
פלואורסצנטיות בסיסית נמדדה, ואז ATP נוסף ב 64 שניות, ותגובת סידן תאית חזקה ניכרה. זמן קצר לאחר מכן, סידן ציטוסולי ממודר בתאים, וירידה באזור התא היה גלוי. ב-300 שניות, אזור התא הצטמצם מאוד, והנוהורסצנטיות ירדה כמעט לרמות הבסיס.
שיטה זו שימשה כדי להשיג את מדידות הסידן תאיים הראשונים מן הפריזיטים נימי המוח העיקרי, הוכחת כי pericytes מגורים באמצעות ATP, והם מסוגלים מתכווצים במבחנה.
