Este es un método simple y eficaz para aislar y cultivar pericitos cerebrales primarios para el estudio de la señalización intercelular de calcio. El cultivo celular obtenido es una población casi homogénea de pericitos, y es sencillo cargar los pericitos para la toma de imágenes de calcio. Los métodos descritos aquí deben proporcionar a otros investigadores en el campo herramientas sólidas para el estudio de la biología de pericitos, y señalización intracelular en pericitos in vitro.
Comience descongelando un vial de capilares en un baño de agua celsius de 37 grados. Una vez que los capilares se hayan descongelado, transfiéralos a un tubo centrífugo con 30 mililitros de DMEM comp, y centrifugarlos durante cinco minutos a 500 veces G.Then, retirar el medio del tubo, y volver a suspender la paleta en 10 mililitros de DM compEM fresco. Transfiera la suspensión a un matraz T-75 recubierto, y permita que los capilares se adhieran al fondo durante cuatro a seis horas en una incubadora de 37 grados Cent grados centígrados suministrada con un 10% de dióxido de carbono.
Después de la incubación, inspeccione el matraz bajo un microscopio de luz. Ahora las fracciones de capilares deben estar unidas a la parte inferior del matraz. En el cuarto día después de sembrar los capilares, inspeccione bajo el microscopio para asegurarse de que son aproximadamente 60 a 70%confluent.
Aspirar el medio y lavar suavemente las células con PBS. Añadir dos mililitros de trippsina-EDTA descongelado, y dejar el matraz en la incubadora durante uno a tres minutos, sacar el matraz con frecuencia y observar el desprendimiento celular con el microscopio. Cuando las células endoteliales comiencen a redondear hacia arriba, toque suavemente el matraz para separarlos.
Cuando las células se hayan desprendido, detenga la tripsinación añadiendo 10 mililitros de DMEM comp al matraz. Enjuague el matraz unas cuantas veces con el medio y aspire la suspensión de la célula endotelial, que ahora se puede utilizar para otros fines. Añadir 10 mililitros de DMEM comp al matraz, y comprobarlo bajo el microscopio de luz para asegurarse de que los pericitos todavía están presentes y unidos a la parte inferior.
Luego, vuelva a colocar el matraz en la incubadora para permitir que el cultivo enriquecido con perito crezca. Para sembrar pericitos en placas recubiertas de 96 pozos, deséstelas como se describe en el manuscrito de texto. Aspirar el medio, teniendo cuidado de no molestar el pellet celular, y volver a suspender el pellet en un mililitro de comp DMEM fresco.
Cuente las células usando una cámara de conteo, luego calcule el volumen de suspensión que se debe agregar a cada pozo para sembrar 10.000 células por pozo. Agregue la suspensión celular, luego agregue suficiente comp DMEM a las células para lograr un volumen total de 200 microlitros por pozo. Cuando esté listo para cargar los pericitos con el tinte indicador de calcio Fura-2 AM, tome la placa de 96 pozos con las células fuera de la incubadora, y aspire el medio de los pozos.
Lave las células dos veces con el búfer de ensayo y agregue 100 microlitros de solución de carga a cada pozo. Envuelva la placa con papel de aluminio para evitar el blanqueo fotográfico, e incubarlo durante 45 minutos con 30 RPM de agitación a temperatura ambiente. Después de la incubación, aspirar el tampón de carga y lavar las células con el tampón de ensayo dos veces.
Agregue 100 microlitros de tampón fresco al ensayo, y deje que las células se incuban durante 30 minutos. Después de la incubación, ajuste la temperatura del lector de placas a 37 grados Celsius, y transfiera la placa de 96 pocillos con las células a la posición de la placa de muestra, luego coloque la placa de reactivo con agonista en la posición de la placa de reactivo. Comience midiendo la carga de las células para asegurar la carga igual de Fura-2 AM en todos los pomos, luego realice las mediciones con longitud de onda de fluorescencia de excitación a 340 a 380 nanómetros, y la longitud de onda de emisión a 510 nanómetros.
Añadir 50 microlitros de agonista, a una velocidad de 150 microlitros por segundo, desde la placa de reactivo a cada pozo con células. Monte un resbalón de cubierta en la cámara de la celda y apriételo para evitar fugas. Agregue DMEM comp y el volumen calculado de suspensión celular en cada cámara, para un volumen final de 500 microlitros.
Incubar las cámaras celulares a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono durante seis días, o hasta que sean confluentes. Una vez que las células son confluentes, saque las cámaras celulares de la incubadora y aspire el medio. Lave las células dos veces con el tampón de ensayo, y agregue 500 microlitros de tampón de carga a cada cámara, luego incubarlas a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Después de la incubación, aspirar el tampón de carga, y lavar las células dos veces con tampón de ensayo, luego añadir 500 microlitros de tampón de ensayo fresco a cada cámara e incubarlas durante otros 30 minutos a temperatura ambiente, para permitir la escisión del éster AM. Sustituya el tampón por 500 microlitros de tampón de ensayo fresco y proceda con imágenes en vivo a un microscopio confocal. Monte la cámara celular en el escenario del microscopio tan suavemente como sea posible para evitar la alteración de las células.
Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros, emisión a 515 nanómetros, adquisición de imagen secuencial de dos minutos con intervalos de cinco segundos y un tamaño de imagen x, y de 512 por 512 píxeles. Agregue 300 microlitros de 100 ATP milimorímes a la cámara celular e inicie la adquisición de imágenes. Este protocolo se utilizó para purificar pericitos de capilares cerebrales bovinos.
El crecimiento celular de los capilares de semillas se hizo una imagen en el transcurso de nueve días. Los capilares estaban completamente unidos al matraz en el primer día, y para el segundo día, la brotación endotelial era visible. Después de cuatro días, el crecimiento celular fue distintivo, y las células endoteliales fueron eliminadas a través de la tripsina.
Los restos de los capilares estaban presentes después de la tripsinación, pero desaparecieron del matraz en los días siguientes. Después de la eliminación de la capa endotelial, se permitió que los pericitos crecieran hasta la confluencia. En el día nueve, los pericitos alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia, y formaron islas.
La adición de ATP a los pericitos cargados Fura-2 dio lugar a un aumento en los niveles de calcio citosólico. La respuesta se produjo inmediatamente después de la adición de ATP a los pericitos, y disminuyó lentamente durante el período de tiempo medido. La respuesta al calcio también se midió con imágenes confocales en tiempo real.
Se midió la fluorescencia basal, luego se agregó ATP a 64 segundos, y una fuerte respuesta intracelular de calcio fue evidente. Poco después, el calcio citosólico compartimentado en las células, y una reducción en el área celular fue visible. En 300 segundos, el área celular se redujo en gran medida, y la fluorescencia disminuyó casi a los niveles basales.
Este método se ha utilizado para obtener las primeras mediciones de calcio intracelular de pericitos capilares primarios del cerebro, demostrando que los pericitos se estimulan a través de ATP, y son capaces de contraer in vitro.
