Questo è un metodo semplice ed efficace per isolare e coltivare i periciti cerebrali primari per lo studio della segnalazione intercellulare del calcio. La coltura cellulare ottenuta è una popolazione quasi omogenea di periciti, ed è semplice caricare i periciti per l'imaging del calcio. I metodi qui descritti dovrebbero fornire ad altri ricercatori del settore strumenti forti per studiare la biologia dei periciti e la segnalazione intracellulare nei periciti in vitro.
Inizia scongelando una fiala di capillari in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Una volta che i capillari si sono scongelati, trasferirli in un tubo di centrifuga con 30 millilitri di dmem comp e centrifugarli per cinque minuti a 500 volte G.Quindi, rimuovere il mezzo dal tubo e sospendere nuovamente la tavolozza in 10 millilitri di dmem comp fresco. Trasferire la sospensione in un pallone T-75 rivestito e consentire ai capillari di aderire al fondo per quattro o sei ore in un incubatore di 37 gradi Celsius fornito con 10% di anidride carbonica.
Dopo l'incubazione, ispezionare il pallone al microscopio leggero. Le frazioni di capillari dovrebbero ora essere attaccate al fondo del pallone. Il quarto giorno dopo la semina dei capillari, ispezionarli al microscopio per assicurarsi che siano circa il 60-70% confluenti.
Aspirare il mezzo e lavare delicatamente le cellule con PBS. Aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA scongelata e lasciare il pallone nell'incubatrice per uno o tre minuti, estraendo frequentemente il pallone e osservando il distacco cellulare con il microscopio. Quando le cellule endoteliali iniziano a arrotondare per l'alto, toccare delicatamente il pallone per staccarle.
Quando le cellule si sono staccate, interrompere la tripsinizzazione aggiungendo 10 millilitri di dmem comp al pallone. Sciacquare il pallone alcune volte con il mezzo e aspirare la sospensione cellulare endoteliale, che ora può essere utilizzata per altri scopi. Aggiungere 10 millilitri di dmem comp al pallone e controllarlo al microscopio luminoso per assicurarsi che i periciti siano ancora presenti e attaccati al fondo.
Quindi, rimetti il pallone nell'incubatrice per consentire alla cultura arricchita di periciti di crescere. Per seminare i periciti in lastre rivestite da 96 pozzi, staccarli come descritto nel manoscritto testuale. Aspirare il mezzo, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare, e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di dmem comp fresco.
Contare le celle utilizzando una camera di conteggio, quindi calcolare il volume di sospensione che deve essere aggiunto a ciascun pozzo per seminare 10.000 cellule per pozzo. Aggiungere la sospensione cellulare, quindi aggiungere abbastanza composizione DMEM alle celle per ottenere un volume totale di 200 microlitri per pozzo. Quando sei pronto a caricare i periciti con il colorante indicatore di calcio Fura-2 AM, prendi la piastra da 96 po 'con le cellule fuori dall'incubatrice e aspira il mezzo dai pozzi.
Lavare le cellule due volte con tampone di dosaggio e aggiungere 100 microlitri di soluzione di carico ad ogni pozzo. Avvolgere il piatto con tinfoil per evitare lo sbiancamento fotografico e incubarlo per 45 minuti con 30 giri/min che tremano a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aspirare il tampone di carico e lavare le cellule con il tampone di dosaggio due volte.
Aggiungere 100 microlitri di fresco al tampone di dosaggio e lasciare che le cellule incubano per 30 minuti. Dopo l'incubazione, impostare la temperatura del lettore di piastre a 37 gradi Celsius e trasferire la piastra da 96 po 'con le celle nella posizione della piastra del campione, quindi posizionare la piastra del reagente con agonista nella posizione della piastra del reagente. Iniziare misurando il carico delle cellule per garantire lo stesso carico di Fura-2 AM in tutti i pozzi, quindi eseguire le misurazioni con lunghezza d'onda di fluorescenza di eccitazione a 340-380 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 510 nanometri.
Aggiungere 50 microlitri di agonista, ad una velocità di 150 microlitri al secondo, dalla piastra del reagente a ogni pozzo con le cellule. Montare un coperchio scivolare nella camera cellulare e stringerlo per evitare perdite. Aggiungere dmem comp e il volume calcolato di sospensione cellulare in ogni camera, per un volume finale di 500 microlitri.
Incubare le camere cellulari a 37 gradi Celsius e 10% di anidride carbonica per sei giorni o fino a quando non sono confluenti. Una volta che le cellule sono confluenti, togliere le camere cellulari dall'incubatrice e aspirare il mezzo. Lavare le cellule due volte con tampone di dosaggio e aggiungere 500 microlitri di tampone di carico a ogni camera, quindi incubarle a temperatura ambiente per 45 minuti.
Dopo l'incubazione, aspirare il tampone di carico e lavare le cellule due volte con tampone di dosaggio, quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di dosaggio fresco a ogni camera e incubarli per altri 30 minuti a temperatura ambiente, per consentire la scissione dell'estere AM. Sostituire il buffer con 500 microlitri di tampone di dosaggio fresco e procedere con l'imaging dal vivo al microscopio confocale. Montare la camera cellulare sul palco del microscopio nel modo più delicato possibile per evitare disturbi delle cellule.
Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nanometri, l'emissione a 515 nanometri, l'acquisizione sequenziale di immagini di due minuti con intervalli di cinque secondi e una dimensione dell'immagine x, y di 512 x 512 pixel. Aggiungere 300 microlitri di ATP da 100 millimolari alla camera cellulare e avviare l'acquisizione di immagini. Questo protocollo è stato utilizzato per purificare i periciti dai capillari cerebrali bovini.
La crescita cellulare dai capillari seminati è stata immagine nel corso di nove giorni. I capillari erano completamente attaccati al pallone al primo giorno, e al secondo giorno, la germinazione endoteliale era visibile. Dopo quattro giorni, la crescita cellulare era distintiva e le cellule endoteliali venivano rimosse attraverso la trippsinizzazione.
I resti dei capillari erano presenti dopo la tripinazione, ma scomparvero dal pallone nei giorni successivi. Dopo la rimozione dello strato endoteliale, ai periciti fu permesso di crescere fino alla confluenza. Il nono giorno, i periciti raggiunsero circa l'80% di confluenza e formarono isole.
L'aggiunta di ATP ai periciti carichi di Fura-2 ha comportato un aumento dei livelli di calcio citosolico. La risposta si è verificata immediatamente dopo l'aggiunta di ATP ai periciti e è diminuita lentamente nel periodo di tempo misurato. La risposta al calcio è stata misurata anche con l'imaging confocale in tempo reale.
È stata misurata la fluorescenza di base, poi l'ATP è stato aggiunto a 64 secondi e una forte risposta intracellulare al calcio è stata evidente. Poco dopo, il calcio citosolico compartimentato nelle cellule, e una riduzione dell'area cellulare era visibile. Di 300 secondi, l'area cellulare si ridusse pesantemente, e la fluorescenza declinò quasi ai livelli di base.
Questo metodo è stato utilizzato per ottenere le prime misurazioni del calcio intracellulare dai periciti capillari cerebrali primari, dimostrando che i periciti sono stimolati tramite ATP e sono in grado di contrarsi in vitro.
