Dies ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären Gehirnperizyten zur Untersuchung der interzellulären Kalziumsignalisierung. Die erhaltene Zellkultur ist eine fast homogene Population von Pericyten, und es ist einfach, die Pericyte für die Kalzium-Bildgebung zu laden. Die hier beschriebenen Methoden sollten anderen Forschern auf diesem Gebiet starke Werkzeuge für die Untersuchung der Pericytbiologie und die intrazelluläre Signalisierung in Pericyten in vitro zur Verfügung stellen.
Beginnen Sie mit dem Auftauen einer Durchstechflasche mit Kapillaren in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Sobald die Kapillaren aufgetaut sind, übertragen Sie sie in ein Zentrifugenrohr mit 30 Milliliter DMEM comp, und zentrifugieren Sie sie für fünf Minuten bei 500 mal G.Dann entfernen Sie das Medium aus dem Rohr, und setzen Sie die Palette in 10 Milliliter frische DMEM comp wieder auf. Übertragen Sie die Suspension auf einen beschichteten T-75-Kolben und lassen Sie die Kapillaren vier bis sechs Stunden lang in einem 37 Grad Celsius-Inkubator mit 10 % Kohlendioxid am Boden haften.
Nach der Inkubation den Kolben unter einem Lichtmikroskop inspizieren. An der Unterseite des Kolbens sollten nun Kapillarfraktionen befestigt werden. Am vierten Tag nach dem Aussaat der Kapillaren, inspizieren Sie sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie etwa 60 bis 70% konfluent sind.
Das Medium ansaugen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen. Fügen Sie zwei Milliliter aufgetauttrypsin-EDTA hinzu und lassen Sie den Kolben für ein bis drei Minuten im Inkubator, nehmen Sie den Kolben häufig heraus und beobachten Sie die Zellablösung mit dem Mikroskop. Wenn die Endothelzellen beginnen, sich aufzurunden, tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um sie zu lösen.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie dem Kolben 10 Milliliter DMEM comp hinzufügen. Spülen Sie den Kolben ein paar Mal mit dem Medium, und aspirieren Sie die Endothelzellsuspension, die jetzt für andere Zwecke verwendet werden kann. Fügen Sie 10 Milliliter DMEM comp in den Kolben, und überprüfen Sie es unter dem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Pericyten noch vorhanden sind und am Boden befestigt sind.
Dann legen Sie den Kolben zurück in den Brutkasten, damit die pericyte-angereicherte Kultur wachsen kann. Um Pericyten in beschichtete 96-Well-Platten zu säen, lösen Sie sie, wie im Textmanuskript beschrieben. Aspirieren Sie das Medium, achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören, Und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer DMEM comp wieder auf.
Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und berechnen Sie dann das Suspensionsvolumen, das jedem Brunnen zueinemmuss, um 10 000 Zellen pro Bohrkörper auszusäen. Fügen Sie die Zellsuspension hinzu, und fügen Sie dann genügend DMEM comp zu den Zellen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 Mikroliter pro Brunnen zu erreichen. Wenn Sie bereit sind, die Pericyten mit Fura-2 AM Calciumindikatorfarbstoff zu laden, nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium aus den Brunnen.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit Assay-Puffer, und fügen Sie 100 Mikroliter Ladelösung zu jedem Brunnen. Wickeln Sie die Platte mit Tinfoil, um Fotobleichungen zu vermeiden, und inkubieren Sie sie für 45 Minuten mit 30 Umdrehungen bei Raumtemperatur schütteln. Nach der Inkubation den Ladepuffer ansaugen und die Zellen zweimal mit dem Assaypuffer waschen.
Fügen Sie 100 Mikroliter frisch in den Testpuffer und lassen Sie die Zellen für 30 Minuten brüten. Stellen Sie nach der Inkubation die Temperatur des Plattenlesers auf 37 Grad Celsius ein und übertragen Sie die 96-Well-Platte mit Zellen in die Probenplattenposition, und legen Sie dann die Reagenzplatte mit Agonist an die Reagenzplattenposition. Beginnen Sie mit der Messung der Belastung der Zellen, um eine gleichmäßige Belastung von Fura-2 AM in allen Brunnen zu gewährleisten, und führen Sie dann die Messungen mit einer Anregungsfluoreszenzwellenlänge von 340 bis 380 Nanometern und der Emissionswellenlänge bei 510 Nanometern durch.
Fügen Sie 50 Mikroliter Agonist, mit einer Geschwindigkeit von 150 Mikroliter pro Sekunde, von der Reagenzplatte zu jedem Brunnen mit Zellen. Montieren Sie einen Deckelrutsch in die Zellkammer und ziehen Sie ihn fest, um Leckagen zu vermeiden. Fügen Sie DMEM comp und das berechnete Volumen der Zellsuspension in jede Kammer, für ein Endvolumen von 500 Mikroliter.
Inkubieren Sie die Zellkammern bei 37 Grad Celsius und 10% Kohlendioxid für sechs Tage, oder bis konfluent. Sobald die Zellen konfluent sind, nehmen Sie die Zellkammern aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Assay-Puffer, und fügen Sie 500 Mikroliter Ladepuffer zu jeder Kammer, dann inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
Nach der Inkubation den Ladepuffer ansaugen und die Zellen zweimal mit Assaypuffer waschen, dann 500 Mikroliter frischen Assaypuffer in jede Kammer geben und sie weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um eine Spaltung des AM-Esters zu ermöglichen. Ersetzen Sie den Puffer durch 500 Mikroliter frischen Assaypuffer, und fahren Sie mit der Live-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop fort. Montieren Sie die Zellkammer auf der Bühne des Mikroskops so schonend wie möglich, um Störungen der Zellen zu vermeiden.
Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer, die Emission auf 515 Nanometer, die zweiminütige sequenzielle Bildaufnahme mit fünf Sekundenintervallen und eine x,y Bildgröße von 512 x 512 Pixeln ein. Fügen Sie 300 Mikroliter 100 Millimolar ATP in die Zellkammer und initiieren Sie die Bildaufnahme. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Pericyten von Rinderhirnkapillaren zu reinigen.
Das zelluläre Auswachsen aus den gesäten Kapillaren wurde im Laufe von neun Tagen abgebildet. Die Kapillaren waren am ersten Tag vollständig an der Flasche befestigt, und am zweiten Tag war endotheliale Keimung sichtbar. Nach vier Tagen war das zelluläre Auswachsen unverwechselbar, und die Endothelzellen wurden durch Trypsinisierung entfernt.
Reste der Kapillaren waren nach der Trypsinisierung vorhanden, verschwanden aber in den folgenden Tagen aus dem Kolben. Nach dem Entfernen der Endothelschicht durften die Pericyten bis zur Zusammenflusswachsen. Am neunten Tag erreichten die Pericyten etwa 80% der Konfluenz und bildeten Inseln.
Die Zugabe von ATP zu den Fura-2-belasteten Pericyten führte zu einem Anstieg des zytosolischen Kalziumspiegels. Die Reaktion trat unmittelbar nach Zugabe von ATP zu den Pericyten auf und ging über den gemessenen Zeitraum langsam zurück. Die Kalzium-Antwort wurde auch mit konfokaler Echtzeit-Bildgebung gemessen.
Die Grundfluoreszenz wurde gemessen, dann wurde ATP bei 64 Sekunden zugegeben, und eine starke intrazelluläre Kalziumreaktion war offensichtlich. Bald darauf wurde das zytosolische Kalzium in den Zellen unterteilt, und eine Verringerung des Zellbereichs war sichtbar. Um 300 Sekunden reduzierte sich die Zellfläche stark, und die Fluoreszenz sank fast auf das Ausgangsniveau.
Diese Methode wurde verwendet, um die ersten intrazellulären Kalziummessungen aus primären Hirnkapillarpericyten zu erhalten, was zeigt, dass Pericyte über ATP stimuliert werden und sich in vitro zusammenziehen können.
