Bu izole ve hücreler arası kalsiyum sinyal çalışması için birincil beyin perisitleri kültüriçin basit ve etkili bir yöntemdir. Elde edilen hücre kültürü perisitlerin neredeyse homojen bir popülasyonudur ve kalsiyum görüntüleme için perisitleri yüklemek kolaydır. Burada açıklanan yöntemler, perisit biyolojisi ve perisit in vitro hücre içi sinyalleme için güçlü araçlar ile alanında diğer araştırmacılar sağlamalıdır.
37 derece santigrat su banyosunda kılcal bir şişe kılcal bir şişe eriterek başlayın. Kılcal damarlar çözüldükten sonra, 30 mililitre DMEM comp içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve 500 kez G.Then'de beş dakika santrifüj edin, tüpün ortasını çıkarın ve paleti 10 mililitre taze DMEM comp'da yeniden askıya alın. Süspansiyonu kaplanmış bir T-75 şişesine aktarın ve kılcal damarların %10 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesinde 4-6 saat dibe yapışmasını bekleyin.
Kuluçkadan sonra, şişeyi hafif bir mikroskop altında inceleyin. Kılcal damar kesirleri artık şişenin altına eklenmelidir. Dördüncü gün kılcal damarları tohumladıktan sonra, yaklaşık %60-70 konca olduğundan emin olmak için mikroskop altında inceleyin.
Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile hafifçe yıkayın. İki mililitre çözülmüş tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi kuvözde bir ila üç dakika bekletin, şişeyi sık sık dışarı alın ve hücre ayrıştırmasını mikroskopla gözlemleyin. Endotel hücreleri toparlamaya başladığında, onları ayırmak için yavaşça şişeye dokunun.
Hücreler ayrıldığında, şişeye 10 mililitre DMEM comp ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Orta ile şişe birkaç kez flush, ve endotel hücre süspansiyon aspire, şimdi başka amaçlar için kullanılabilir. Şişeye 10 mililitre DMEM comp ekleyin ve perisitlerin hala mevcut olduğundan ve dibe bağlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskobu altında kontrol edin.
Sonra, perisitle zenginleştirilmiş kültürün büyümesine izin vermek için şişeyi kuvöze geri koyun. Perisitleri kaplamalı 96 kuyulu plakalara tohumlamak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi ayırın. Aleti aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye özen gösterin ve bir mililitre taze DMEM comp'da peleti yeniden askıya alın.
Hücreleri bir sayma odası kullanarak sayın, sonra her kuyuya eklenmeli süspansiyon hacmini hesaplayın tohum 10, kuyu başına 000 hücreleri. Hücre süspansiyon ekleyin, sonra iyi başına 200 mikrolitre toplam hacmi elde etmek için hücrelere yeterli DMEM comp ekleyin. Perisitleri Fura-2 kalsiyum indikatörü boyaile yüklemeye hazır olduğunuzda, 96-iyi plakayı kuvözden hücrelerle alın ve ortayı kuyulardan aspire edin.
Hücreleri iki kez tsay arabelleği ile yıkayın ve her kuyuya 100 mikrolitre yükleme çözeltisi ekleyin. Fotoğraf beyazlatma önlemek için folyo ile plaka sarın ve oda sıcaklığında sallayarak 30 RPM ile 45 dakika kuluçka. Kuluçkadan sonra, yükleme tamponunu aspire edin ve hücreleri iki kez temizleme tamponuyla yıkayın.
Arama arabelleği için 100 mikrolitre taze ekleyin ve hücreleri 30 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, plaka okuyucunun sıcaklığını 37 dereceye ayarlayın ve hücrelerle birlikte 96 kuyuluk plakayı örnek plaka konumuna aktarın, ardından reaktif plakası ile reaktif plakasını reaktif plaka pozisyonuna yerleştirin. Tüm kuyularda Fura-2 eşit yükleme sağlamak için hücrelerin yükleme ölçerek başlayın, sonra 340 ila 380 nanometre uyarma floresan dalga boyu ile ölçümleri gerçekleştirmek ve 510 nanometre emisyon dalga boyu.
50 mikrolitre agonist ekleyin, saniyede 150 mikrolitre hızda, reaktif plakadan hücrelerle her kuyuya. Hücre odasına bir kapak kapağı tonuyla ve sızıntıları önlemek için sıkın. 500 mikrolitrelik son hacim için dmem comp ve her bir odaya hücre süspansiyonu hesaplanan hacmi ekleyin.
Hücre odalarını 37 santigrat derecede ve %10 karbondioksitle altı gün veya konfluent olana kadar kuluçkaya yatırın. Hücreler bir araya geldikten sonra, hücre odalarını kuvözden alın ve ortamı aspire edin. Hücreleri iki kez tisme arabelleği ile yıkayın ve her odaya 500 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin, ardından 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, yükleme tamponu aspire, ve test tampon ile iki kez hücreleri yıkayın, sonra her odaya taze test tampon 500 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında başka bir 30 dakika kuluçka, ester bölünmesi sağlamak için. Tamponu 500 mikrolitre taze arsay arabelleği ile değiştirin ve konfokal mikroskopta canlı görüntülemeye devam edin. Hücrelerin bozulmasını önlemek için hücre odasını mikroskopun sahnesine mümkün olduğunca hafifçe monte edin.
Uyarma dalga boyunu 488 nanometre, emisyon 515 nanometre, beş saniyelik aralıklarla iki dakikalık sıralı görüntü edinimi ve 512 x12 x12 x12 y görüntü boyutuna ayarlayın. Hücre odasına 100 milimolar ATP 300 mikrolitre ekleyin ve görüntü edinimi başlatın. Bu protokol, perisitleri büyükbaş beyin kılcal damarlarından arındırmak için kullanılmıştır.
Tohumlu kılcal damarlardan hücresel büyüme dokuz gün boyunca görüntülendi. Kılcal damarlar ilk gün şişeye tamamen bağlıydı ve ikinci gün endotel filizlenmesi görülebiliyordu. Dört gün sonra, hücresel büyüme belirgin oldu, ve endotel hücreleri tripsinizasyon yoluyla kaldırıldı.
Kapiller kalıntıları tripsinizasyondan sonra mevcuttu, ancak sonraki günlerde şişeden kayboldu. Endotel tabakası nın çıkarılmasından sonra perisitlerin biraraya gelene kadar büyümesine izin verildi. Dokuzuncu günde perisitler yaklaşık %80 biraraya gelmiş ve adalar oluşturmuşlar.
Fura-2 yüklü perisitlere ATP eklenmesi sitosolik kalsiyum düzeylerinde artışa yol açtı. Yanıt perisitlere ATP eklenmesinden hemen sonra oluştu ve ölçülen zaman dilimi içinde yavaş yavaş azaldı. Kalsiyum yanıtı da gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile ölçüldü.
Bazal floresans ölçüldü, sonra ATP 64 saniyede eklendi ve güçlü bir hücre içi kalsiyum yanıtı belirgindi. Kısa bir süre sonra, hücrelerde sitosolik kalsiyum bölümlere ayrılmış ve hücre alanında bir azalma görülebilir. 300 saniye ile hücre alanı ağır bir şekilde azaldı ve floresan neredeyse taban çizgisi seviyelerine geriledi.
Bu yöntem, perisitlerin ATP ile uyarıldığını ve in vitro olarak bulaşabildiğini gösteren primer beyin kapiller perisitlerinden ilk hücre içi kalsiyum ölçümlerini elde etmek için kullanılmıştır.
