따라서 인간 게놈에서 DNA 메틸화의 복잡한 수차를 위한 LA 플랫폼을 가진 DNA 메틸화 게놈 전체 분석은 위장암에 있는 후생유전학 바이오마커의 중요한 정보를 제공할 수 있다. 인간 게놈에서 DNA 메틸화의 복잡한 수차를 위한 이 LA 플랫폼은, 비용 및 게놈 엄호의 관점에서 최적입니다. 그래서 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 히로타카 모모세 (Hirotaka Momose)가 될 것입니다.
시작하려면, 스테인드 포름핀 고정 파라핀 임베디드 섹션의 10 마이크로 미터를 준비합니다. 슬라이드를 유리 슬라이드 홀더에 놓고 식염수로 채우면 슬라이드의 모든 조직이 침수되었는지 확인합니다. 15 분 동안 자일렌에 슬라이드를 두고, 그들이 빠지지 않도록 피펫 팁슬라이드를 들고 있는 동안 자일렌을 부어.
이전과 같은 수준으로 더 많은 자일렌을 붓고 인큐베이션을 반복합니다. 자일렌을 붓고 슬라이드 홀더를 100% 에탄올로 채우고 슬라이드의 모든 조직이 완전히 침수되었는지 확인합니다. 슬라이드를 에탄올에 3분간 남긴 다음 에탄올을 신선한 에탄올로 교체하고 2분 더 배양할 수 있도록 합니다.
에탄올을 붓고 슬라이드를 제거합니다. 깨끗한 종이 타월에 조심스럽게 올려놓고 10분 동안 건조시키십시오. 1.5 밀리리터 일회용 폴리프로필렌 튜브에 80마이크로리터의 용해 버퍼를 채우고 깨끗한 파이펫 팁을 버퍼에 넣습니다.
적절한 H&E 염색 섹션에 따라 거시분해에 가장 적합한 종양 영역의 암 조직을 확인한 다음 표시된 단면을 기반으로 암 조직을 거시화한다. 깨끗한 면도날을 가지고 부드럽게 한 조각으로 유지하려고 슬라이드에서 암 조직을 긁어. 파이펫 팁을 사용하여 긁힌 조직을 용해 완충병으로 옮길 수 있습니다.
슬라이드의 나머지 부분과 함께 이 프로세스를 반복합니다. 모든 조직이 튜브에 있는 후에, 조직이 완전히 잠기고 벽에 붙어 있지 않다는 것을 확인하기 위하여 팁을 이용하십시오. 바이알에 서브틸리신 관련 세린 프로테아제 20 마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞어주세요.
바이알을 섭씨 55도 의 열 블록에 적어도 4 시간 또는 하룻밤 동안 배치하여 2 시간 후에 약간 소용돌이해야합니다. 제조업체의 지시에 따라 비설피트 변환 키트를 사용하여 소화된 조직의 45 마이크로리터에서 비설피트 치료를 수행하십시오. 5마이크로리터의 희석 버퍼를 샘플에 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
한편, 증류수 750마이크로리터와 210마이크로리터의 희석 버퍼를 CT 변환 시약 의 한 튜브에 추가하여 양성환 변환 시약을 준비한다. 10 분 동안 소용돌이에 의해 튜브를 혼합 한 다음 각 샘플에 준비 된 CT 변환 시약의 100 마이크로 리터를 추가하고 반전으로 혼합합니다. 12~16시간 동안 50도의 어둠 속에서 샘플을 배양합니다.
인큐베이션 후 샘플을 얼음 위에 10분 간 놓습니다. 바인딩 버퍼의 400 마이크로 리터를 추가하고 위아래로 파이펫하여 각 샘플을 혼합합니다. 각 샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 컬럼을 2밀리리터 수집 튜브에 넣습니다.
샘플을 1분 동안 최고 속도로 원심분리하고 흐름을 폐기합니다. 각 컬럼에 200마이크로리터의 워시 버퍼를 추가하고 1분 동안 최고 속도로 회전한 다음 흐름을 폐기합니다. 각 열에 200 마이크로리터의 황하 버퍼를 추가하고 기둥이 실온에서 15분 동안 서 도록 합니다.
인큐베이션 후 1분 동안 최고 속도로 열을 회전시키고 흐름을 폐기합니다. 매 세척 후 최대 속도로 1 분 동안 세척 버퍼 원심 분리200 마이크로 리터로 컬럼을 두 번 세척하십시오. 각 컬럼에 증류수 46마이크로리터를 넣고 새로운 멸균 1.5 밀리리터 일회용 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다.
2 분 동안 튜브를 회전하여 DNA를 엘로우고 컬럼을 폐기하십시오. DNA는 지금 분석을 위한 준비가 되었습니다. 각 유전자 분석에서 프로모터 영역의 메틸화를 평가하기 위해 정량적 메틸화 특이 PCR을 위한 템플릿으로서 비설피테 변형 DNA를 사용합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 시약을 결합하고 96웰의 실시간 PCR 계측기를 사용하여 열 순환 프로토콜을 실행합니다. 훈련 코호트에서 위암 환자 48명의 특성이 여기에 나와 있다. 환자의 평균 연령은 74 세였고 코호트는 38 명의 남성과 10 명의 여성을 포함했습니다.
첫째, 이상값을 식별하기 위해 48개의 샘플이 모두 로드되었습니다. 두 개의 샘플은 다른 샘플에서 변위된 두 개의 표준 편차보다 큰 피크를 주었고 이러한 샘플은 제거되었습니다. 결과 열지도는 높고 낮은 메틸화를 기반으로 두 그룹으로 나뉘었다.
이 히트 맵을 사용하면 차동 메틸화 분석에서 전사 시작 부위의 1, 500개의 기본 쌍 내에서 상위 50개의 프로브를 시각화할 수 있습니다. 임상 병리학 적 인자가 다변량 분석에서 코바레로 사용될 때 암의 유형과 림프절 전이의 존재는 중요한 독립적 인 예측 요인으로 나타났다. 마지막으로, EPB41L3 유전자는 마이크로어레이 분석에서 훈련 코호트를 높고 낮은 메틸화 그룹으로 명문화하는 것과 강하게 연관된 것으로 나타났다.
시험 코호트에서 EPB41L3에 대한 마이크로어레이 분석의 결과는 정량적 메틸화 특이PCR으로 검증되었다. PGC 조직에서 EPB41L3의 RMV는 단변면 분석에서 잔류 위암에 있는 그 보다는 상당히 높았습니다. 마찬가지로, 림프절 전이를 가진 샘플에서 RMV는 림프절 전이가없는 샘플보다 상당히 높았다.
따라서 적절한 H&E 스테인드 섹션에 따라 거시분해에 가장 적합한 암 조직에 대한 식별이 이 프로토콜을 성공적으로 수행하기 위해서는 요구된다.
