Quindi l'analisi a livello genomico della metilazione del DNA con la piattaforma la per l'aberrazione complessa della metilazione del DNA nel genoma umano può fornire importanti informazioni sui biomarcatori epigenetici nel cancro gastrointestinale. Sebbene questa piattaforma di Los Angeles per l'aberrazione complessa della metilazione del DNA nel genoma umano, è ottimale in termini di costi e copertura genomica. Quindi a dimostrare la procedura sarà Hirotaka Momose, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Per iniziare, preparare 10 micrometri di sezioni incorporate di paraffina fissa formalina non macchiata. Posizionare le diapositive in un portas vetri e riempirla con soluzione salina, assicurandosi che tutto il tessuto sullo scivolo sia sommerso. Lasciare le diapositive in xilene per 15 minuti, quindi versare lo xilene tenendo le diapositive con una punta di pipetta in modo che non cadano.
Versare più xilene allo stesso livello di prima e ripetere l'incubazione. Versare lo xilene e riempire il supporto scorrevole con etanolo al 100%, assicurandosi che tutto il tessuto sullo scivolo sia completamente sommerso. Lasciare le diapositive nell'etanolo per tre minuti, quindi sostituire l'etanolo con etanolo fresco e consentire loro di incubare per altri due minuti.
Versare l'etanolo e rimuovere le diapositive. Posizionarli con cura a faccia in su un tovagliolo di carta pulito e lasciare asciugare per 10 minuti. Riempire un tubo di polipropilene mono impiego da 1,5 millilitri con 80 microlitri di tampone di lisi e mettere una punta di pipetta pulita nel tampone.
Identificare i tessuti tumorali dell'area tumorale più adatti alla macrodisezione secondo l'appropriata sezione macchiata di H&E, quindi macrodissezione del tessuto tumorale in base alla sezione contrassegnata. Prendi una lama di rasoio pulita e raschia delicatamente il tessuto tumorale dalla diapositiva cercando di tenerlo in un unico pezzo. Utilizzare la punta della pipetta per trasferire il tessuto raschiato nella fiala tampone di lisi.
Ripetere questo processo con il resto delle diapositive. Dopo che tutto il tessuto è nel tubo, utilizzare la punta per assicurarsi che il tessuto sia completamente sommerso e non sia attaccato al muro. Aggiungere 20 microlitri di una proteasi serina correlata alla subtilicina al flaconcino e scorrere delicatamente per mescolare.
Posizionare il flaconcino in un blocco di calore di 55 gradi Celsius per almeno quattro ore o durante la notte, assicurandosi di vortice leggermente dopo due ore. Eseguire il trattamento con bisolfito su 45 microlitri del tessuto digerito utilizzando un kit di conversione della bisolfito secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere cinque microlitri di tampone di diluizione al campione e incubarlo a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Nel frattempo, preparare il reagente di conversione della bisulfite aggiungendo 750 microlitri di acqua distillata e 210 microlitri di tampone di diluizione a un tubo di reagente di conversione CT. Mescolare i tubi a vortice per 10 minuti, quindi aggiungere 100 microlitri del reagente di conversione CT preparato a ciascun campione e mescolare per inversione. Incubare i campioni al buio a 50 gradi Celsius per 12-16 ore.
Dopo l'incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti. Aggiungere 400 microlitri di tampone di legame e mescolare ogni campione pipettando su e giù. Caricare ogni campione in una colonna di rotazione e posizionare la colonna in un tubo di raccolta di due millilitri.
Centrifugare i campioni a tutta velocità per un minuto e scartare il flusso. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio a ogni colonna e ruotare a tutta velocità per un minuto, quindi scartare il flusso. Aggiungere 200 microlitri di tampone di desolfonazione a ogni colonna e lasciare riposare le colonne a temperatura ambiente per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, ruotare le colonne a tutta velocità per un minuto e scartare il flusso. Lavare la colonna due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio centrifugando per un minuto a tutta velocità dopo ogni lavaggio. Aggiungere 46 microlitri di acqua distillata ad ogni colonna e posizionare in un nuovo tubo sterile in polipropilene monouso da 1,5 millilitri.
Ruotare i tubi per due minuti per elutare il DNA e scartare la colonna. Il DNA è ora pronto per l'analisi. Usa il DNA modificato dalla bisolfito come modello per la PCR quantitativa specifica della metilazione per valutare la metilazione della regione promotrice in ogni analisi genica.
Combina i reagenti come descritto nel manoscritto testuale e usa uno strumento PCR in tempo reale da 96 po 'per eseguire il protocollo thermo cycling. Le caratteristiche di 48 pazienti con cancro gastrico nella coorte di allenamento sono mostrate qui. L'età media dei pazienti era di 74 anni e la coorte comprendeva 38 maschi e 10 femmine.
In primo luogo, tutti i 48 campioni sono stati caricati per l'identificazione degli outlier. Due campioni hanno dato picchi superiori a due deviazioni standard spostati dagli altri e questi campioni sono stati rimossi. La mappa termica risultante è stata divisa in due gruppi basati su metilazione alta e bassa.
Questa mappa termica consente la visualizzazione delle prime 50 sonde entro 1.500 coppie di basi del sito iniziale trascrizionale nell'analisi della metilazione differenziale. Il tipo di cancro e la presenza di metastasi linfonodo sono emersi come fattori predittivi indipendenti significativi quando i fattori patologici clinici sono stati utilizzati come covariati nell'analisi multivariata. Infine, il gene EPB41L3 è stato trovato fortemente associato alla codifica della coorte di addestramento in gruppi di metilazione alti e bassi nell'analisi dei microarray.
I risultati dell'analisi del microarray per EPB41L3 nella coorte di prova sono stati convalidati con PCR quantitativa specifica per la metilazione. Gli RMV di EPB41L3 nei tessuti PGC erano significativamente più alti di quelli nel cancro gastrico residuo nell'analisi univariata. Allo stesso modo, gli RMV in campioni con metastasi linfonodo erano significativamente più alti di quelli senza metastasi linfonodo.
Quindi l'identificazione sul tessuto tumorale più adatto per la macrodisezione secondo l'appropriata sezione macchiata di H&E è necessaria per eseguire con successo questo protocollo.
