Por lo tanto, el análisis del genoma de la metilación del ADN con la plataforma LA para la aberración compleja de la metilación del ADN en el genoma humano puede proporcionar información importante de biomarcadores epigenéticos en el cáncer gastrointestinal. Aunque esta plataforma de LA para la aberración compleja de la metilación del ADN en el genoma humano, es óptima en términos de costo y cobertura genómica. Así que demostrar el procedimiento será Hirotaka Momose, un estudiante graduado de mi laboratorio.
Para empezar, prepare 10 micrómetros de secciones incrustadas de parafina fijada en formalina no manchada. Coloque las diapositivas en un portaobjetos de vidrio y llénelo con solución salina, asegurándose de que todo el tejido de la diapositiva esté sumergido. Deje los portaobjetos en xileno durante 15 minutos, luego vierta el xileno mientras sostiene los portaobjetos con una punta de pipeta para que no se caigan.
Vierta más xileno al mismo nivel que antes y repita la incubación. Vierta el xileno y llene el portaobjetos con 100% etanol, asegurándose de que todo el tejido de la diapositiva esté completamente sumergido. Deje los portaobjetos en el etanol durante tres minutos, luego reemplace el etanol con etanol fresco y déjelos incubar durante dos minutos más.
Vierta el etanol y retire las diapositivas. Colóquelos cuidadosamente boca arriba sobre una toalla de papel limpia y dérelos secar durante 10 minutos. Llene un tubo de polipropileno de un solo uso de 1,5 mililitros con 80 microlitros de tampón de lysis y coloque una punta de pipeta limpia en el tampón.
Identificar los tejidos cancerosos de la zona tumoral más adecuada para la macrodisección de acuerdo con la sección adecuada de H&E teñida, luego macrodiseccionar el tejido canceroso basado en la sección marcada. Tome una cuchilla de afeitar limpia y raspe suavemente el tejido canceroso de la diapositiva tratando de mantenerlo en una sola pieza. Utilice la punta de la pipeta para transferir el tejido raspado al vial de tampón de lysis.
Repita este proceso con el resto de las diapositivas. Después de todo el tejido está en el tubo, utilice la punta para asegurarse de que el tejido estaba completamente sumergido y no está pegado a la pared. Añadir 20 microlitros de una proteasa de serina subtilisin al vial y deslizar suavemente para mezclar.
Coloque el vial en un bloque de calor celsius de 55 grados durante al menos cuatro horas o durante la noche, asegurándose de dar un poco de vórtice después de dos horas. Realizar el tratamiento con bisulfito en 45 microlitros del tejido digerido utilizando un kit de conversión de bisulfito de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir cinco microlitros de tampón de dilución a la muestra e incubarlo a 37 grados Centígrados durante 15 minutos.
Mientras tanto, prepare el reactivo de conversión de bisulfito añadiendo 750 microlitros de agua destilada y 210 microlitros de tampón de dilución a un tubo de reactivo de conversión por TC. Mezclar los tubos por vórtice durante 10 minutos, luego añadir 100 microlitros del reactivo de conversión de TC preparado a cada muestra y mezclar por inversión. Incubar las muestras en la oscuridad a 50 grados centígrados durante 12 a 16 horas.
Después de la incubación, coloque las muestras sobre hielo durante 10 minutos. Agregue 400 microlitros de búfer de unión y mezcle cada muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cargue cada muestra en una columna de centrifugado y coloque la columna en un tubo de recolección de dos mililitros.
Centrifugar las muestras a toda velocidad durante un minuto y desechar el flujo a través. Agregue 200 microlitros de tampón de lavado a cada columna y gire a toda velocidad durante un minuto, luego deseche el flujo a través. Agregue 200 microlitros de tampón de desulfonación a cada columna y permita que las columnas se pongan de pie a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Después de la incubación, gire las columnas a toda velocidad durante un minuto y deseche el flujo a través. Lave la columna dos veces con 200 microlitros de centrifugación de tampón de lavado durante un minuto a toda velocidad después de cada lavado. Agregue 46 microlitros de agua destilada a cada columna y colóquelo en un nuevo tubo de polipropileno estéril de 1,5 mililitros de un solo uso.
Gire los tubos durante dos minutos para eluir el ADN y desechar la columna. El ADN ya está listo para el análisis. Utilice el ADN modificado de bisulfito como plantilla para pcR cuantitativo específico para la metilación para evaluar la metilación de la región promotora en cada análisis genético.
Combine los reactivos como se describe en el manuscrito de texto y utilice un instrumento PCR en tiempo real de 96 pozos para ejecutar el protocolo de ciclo térmico. Las características de 48 pacientes con cáncer gástrico en la cohorte de entrenamiento se muestran aquí. La mediana de edad de los pacientes era de 74 años y la cohorte incluía 38 hombres y 10 mujeres.
En primer lugar, las 48 muestras fueron cargadas para la identificación de valores atípicos. Dos muestras dieron picos que eran mayores que dos desviaciones estándar desplazadas de las otras y estas muestras fueron eliminadas. El mapa de calor resultante se dividió en dos grupos basados en la metilación alta y baja.
Este mapa de calor permite visualizar las 50 sondas superiores dentro de 1.500 pares base del sitio de inicio transcripcional en el análisis de metilación diferencial. El tipo de cáncer y la presencia de metástasis de los ganglios linfáticos surgieron como factores predictivos independientes significativos cuando los factores patológicos clínicos se utilizaron como covariables en el análisis multivariado. Por último, se encontró que el gen EPB41L3 estaba fuertemente asociado con la codificación de la cohorte de entrenamiento en grupos de metilación altos y bajos en el análisis de microarray.
Los resultados del análisis de microarray para EPB41L3 en la cohorte de pruebas se validaron con PCR cuantitativo específico para la metilación. Los RMV de EPB41L3 en los tejidos PGC fueron significativamente más altos que los del cáncer gástrico remanente en el análisis univariado. Del mismo modo, los RMVs en muestras con metástasis de ganglios linfáticos fueron significativamente más altos que aquellos sin metástasis de ganglios linfáticos.
Por lo tanto, se requiere la identificación en el tejido canceroso más adecuado para la macrodisección de acuerdo con la sección manchada de H&E adecuada para realizar con éxito este protocolo.
