LPE هو زميل الاسكتلندي السريرية كبير ويعترف بدعم من مكتب كبير العلماء (SCD/03). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المشروع ويلكوم ترست المنح لLPE (089930). وقد تم تمويل المنح من قبل NARG ويلكوم ترست برنامج (080088) ومنحة معدات (075470) (للDeltaVision)، ومنحة FP7-2007-2013 (HEALTH-F2-2010-260338-ALLFUN). نود أن نشكر جامعة أبردين مرفق التصوير، في ماكينزي كيفن وجه الخصوص، للحصول على الدعم والمشورة مفيدة.

1. C. البيض النمو والشروط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات أجار SC-أورا بإضافة 6،9 النيتروجين ز الخميرة دون قاعدة الأحماض الأمينية، 1 مل 1 M هيدروكسيد الصوديوم، 10 مل 1٪ (W / V) الأدينين الملح hemisulphate و 20 ز أغار التقنية (التي سبق وصفها بالتفصيل في 11). تشكل إلى 900 مل حجم المقطر مع O. 2 H الأوتوكلاف، والسماح لتبرد أجار، ولكن ليس بما يكفي لترسيخ، ثم قم بإضافة 50 مل العقيمة 40٪ D-غلوكوز و 50 مل العقيمة 4٪ التسرب SC-أورا في ظل ظروف معقمة. خلط، تصب في أطباق بتري ويترك ليبرد لوحات أجار ويصلب. لوحات أجار المحل في 5 ° C حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط C. البيض النمط المصلي A + سلالة CAI4 CIp10 من المخزونات الجلسرين تخزينها في -80 درجة مئوية إلى لوحة أجار SC-أورا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في 30 ° C حتى شكل مستعمرات وتخزينها في 5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة واحدة C. البيض مستعمرة في 5 المتوسطة SC-أورا مل (كما هو الحال في وصفة 1.1، ولكن من دون أجار التقنية) واحتضان بين عشية وضحاها في 30° C، 200 دورة في الدقيقة لتوليد ثابتة C. المرحلة البيض. </li></ol> 2. C. البيض تلوين باستخدام ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر C. البيض الثقافة بين عشية وضحاها إلى 990 ميكرولتر PBS (درجة الحموضة 7.4) وتنفيذ عدد خلايا باستخدام haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمساعدة التصور من C. البيض خلال فحوصات البلعمة، وصمة عار 1 × 10 8 C. البيض باستخدام 1 ملغ / مل في FITC 0،05 العازلة كربونات بيكربونات-M (الرقم الهيدروجيني 9.6) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة FITC غير منضم، وغسل C. البيض في 1 مل PBS × 1، الطرد المركزي في 3،000 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف بيليه وresuspend في 1 مل PBS × 1. كرر 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 1 × 10 6 خلية / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني × 1. </li></ol> 3. إعداد الخط الخليوي ماوس J774.1 البلاعم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على J774.1 الضامة الأنسجة في 75 2 سمقوارير الثقافة في المتوسطة DMEM تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS)، 200 U / مل البنسلين / الستربتوميسين و2 مم L-الجلوتامين في 37 ° C مع 5٪ CO 2. يوصف إعداد الضامة الأساسي في أي مكان آخر في التفاصيل 12 و 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلص الخلايا من J774.1 الأنسجة قارورة الثقافة ونقلها إلى أنبوب 50 مل الصقر. الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بيليه وresuspend في 10 مل قبل تحسنت المتوسطة DMEM تستكمل. عد الخلايا باستخدام لوحة haemocytometer و1 × 10 6 J774.1 الضامة في 2 مل تستكمل DMEM المتوسطة في طبق زجاج 35 مم التصوير مقرا لها. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير، واستبدال تستكمل DMEM المتوسطة مع 2 مل قبل تحسنت تستكمل CO 2-المستقلة المتوسطة (مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS)، 200 U / مل البنسلين / الستربتوميسين و2 مم L-الجلوتامين) تحتوي على 1 ميكرومتر الأحمر LysoTracker DND-99.</li></ol> 4. فيديو حية مجهرية الخلية البلعمة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المجهر سوف تعتمد على ما هو متوفر محليا، ولكن الإعداد المجهر سوف تحتاج إلى تضمين مرحلة مقلوب، وغرفة البيئية تسخينها إلى 37 درجة مئوية والإثارة / الانبعاثات المرشحات لاختيار البقع (FITC وTRITC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المدفأة المجهر قبل التجربة وإتاحة الوقت الكافي لدائرة مراقبة البيئة الحارة إلى 37 ° C. فإن الوقت الذي يستغرقه لدرجة حرارة الغرفة لتحقيق الاستقرار تختلف عن الاجهزة المجهر مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على المجهر والكمبيوتر، وتحميل البرمجيات التصوير. تحميل طبق التصوير على المسرح المجهر وضبط التركيز للعثور على الضامة J774.1. تحسين مظهر الصور TRITC ومدينة دبي للإنترنت عن طريق ضبط نسبة الضوء المرسل والأوقات التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبق التصوير وإضافة 3 × 10 6 FITC الملطخة C. البيض لرانه طبق. تسجيل الوقت الذي C. يضاف البيض إلى الطبق. إعادة الإناء لمرحلة وتحسين مظهر الصور FITC إذا لزم الأمر. إعداد قائمة نقاط إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ التصوير عند كل نقطة في التركيز وهي الأمثل القنوات. القبض على FITC والصور وTRITC DIC كل دقيقة لمدة 6 ساعة. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف. NG هو المستفيد من الدعم غير المحدود لمنح البحوث الأساسية من العلوم جلعاد. LE يعمل كمستشار لتطوير العقاقير GSK في وقت مبكر.

هنا يتم وصف طريقة لاستخدام المجهر لقطات فيديو حية خلايا البلعمة لدراسة البلاعم. المجهر الفيديو يوفر طبقات متعددة من المعلومات الإضافية لتحليلها. واحد الميزة الأساسية هي أن البيانات يمكن أن تتولد امتصاص (من تجربة واحدة) عن أي نقطة زمنية خلال الفترة من 6 الملاحظة ساعة. الأهم من ذلك، يمكن وصف أسلوب التحليل التفاضلي للمراحل البلعمة الفردية. لدينا، على سبيل المثال، أظهرت أن التغيرات في امتصاص العام للC. يمكن البيض ارتباط بالغليكوزيل والمسوخ التشكل من خطوط الخلايا الضامة والبلاعم الأولية يكون إما نتيجة للتغيرات في الهجرة نحو البلاعم أو الخلايا المستهدفة معدل الإحاطة مرة واحدة خلية خلية الاتصال يتم تأسيس 7. هناك عدد من لتجنب المزالق عند إجراء هذه التجارب. أولا، من المهم جدا لضمان الظروف البيئية المستقرة في جميع أنحاء اإلجراءات التجريبية<html> dure. ويتحقق هذا أفضل في غرفة البيئية التي تم تعيينها للشروط التجريبية عدة ساعات قبل بدء التجربة. جودة الفيديو تعتمد اعتمادا كبيرا على وحدات متطورة ليزر الأشعة تحت الحمراء التي تستخدم للحفاظ على عينة تلقائيا Z-موقف بغض النظر عن التغييرات الميكانيكية أو الحرارية وبالتالي القضاء على الحاجة إلى التركيز اليدوي التصحيحات. نظرا لطبيعة ممتدة من التجارب، من المهم للحد من التعرض للضوء ليزر وما يرتبط بها من آثار وphotobleaching photoconversion، والتي يمكن أن يكون الحد الأدنى من خلال توظيف علامات الفلورسنت للغاية، والتي تسهل مرات التعرض المنخفضة. بروتوكول الموصوفة هنا تلطيخ FITC سريعة وموثوق بها. كما هو مطلوب FITC مشرق جدا ومستقرة وصمة عار، وأوقات التعرض المنخفضة وهذا ما يجعل مثالية للأفلام FITC الوقت الفاصل بين الموسعة. ومع ذلك، ونحن نستخدم بشكل روتيني مجموعة متنوعة من البقع المستهدفة المختلفة، بما في ذلك الأصباغ والأبيض Calcofluor PKH وكذلك الكائنات المفتاحية. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ويجري معظم عملنا نشرت باستخدام مجهر اسعة المجال، ولكن يمكن التقليل من التعرض مزيد باستخدام المجهر متحد البؤر القرص الغزل وبين أيدينا هذا أمر ضروري لمرور الزمن المجهر الفيديو 3D. خلال هذه الدراسة تم التقاط الصور على فترات أكثر من حد أدنى 1 مقايسة البلعمة 6 ساعة. ويمكن تعديل الفاصل الزمني بين الصور اعتمادا على عملية قيد التحقيق. على سبيل المثال، يمكن أن تنخفض الفاصل عند التحقيق السريع مثل عمليات الاتجار حويصلي. وستقتصر الفترة الزمنية الدنيا من المواصفات المجهر والكاميرا. هناك بعض الاعتبارات أن يوضع في الاعتبار عند تعديل توقيت. أولا، سوف تقليل الفاصل الزمني بين لقطات يعني ولا يمكن تصوير أقل نقطة وسيتم زيادة حجم الملف كبير. على العكس من ذلك، سوف زيادة الفاصل الزمني الصورة كثيرا جعل الفيلم يفقد الاستمرارية. ويمكن تطبيق هذا النهجمن حيث المبدأ لدراسة مسببات الأمراض الأخرى وامتصاص الخلايا للموت المضيف. على سبيل المثال، لقد أظهرنا مؤخرا الذي يحمل تقلص إلى حد كبير نقي العظم الضامة المستمدة من الفئران التي تعاني من نقص sialoadhesin ملزمة والبلعمة من الصائمية العطيفة sialylated 8. ومع ذلك، حجم الهدف هو من العوامل الهامة للجدوى، وتحليل الصور يصبح من الصعب على نحو متزايد مع انخفاض في حجم الخلية المستهدفة. برامج متطورة تحليل الصور ضروري لتحليل الفيديو السريع المجهري، وينبغي أن يقترن هذا مع دعم المعلوماتية الحيوية المناسبة لتسهيل توليد خوارزميات لدراسة هجرة الخلايا الفردية والسكان الخلية بأكملها 7. الخلية الحية المجهري الفيديو في تركيبة متطورة مع صورة برامج التحليل لتحليل دقيقة تلو الدقيقة للهجرة والفردية التفاعلات البلاعم-كانديدا البيكانز، يقدم رؤية فريدة من نوعها في تعقيد C. البيض البلعمة من قبل macrophagوفاق. هناك إمكانات هائلة لتوسيع هذه الأساليب لدراسة مسببات الأمراض الأخرى والبالعات (الخلايا الجذعية، والعدلات) ووضع الفيديو إلى 3D المجهر التفاعلات الخلية خلية صورة بمزيد من التفصيل أو أكثر على الأسطح الفسيولوجية مثل طبقات الخلايا الظهارية والبطانية. هذه التقنية هي جزء من الجيل القادم من أدوات في دراسة المضيف الممرض التفاعلات وسوف يساعد على توليد معلومات مفصلة المكانية والزمانية على مجموعة واسعة من العمليات الحيوية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> الخميرة قاعدة النيتروجين دون الأحماض الأمينية </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> الأدينين hemisulphate الملح </td><td> سيجما </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> التقنية أجار (رقم 3) </td><td> OXOID </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-غلوكوز </td><td> سيجما </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-أورا التسرب </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> سيجما </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> كربونات الصوديوم </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </TD&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker الأحمر DND-99 </td><td> إينفيتروجن </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 مم الزجاج الأطباق </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

إزالة مسببات الأمراض الفطرية من أكلة، والكائنات الحية الدقيقة بصورة عامة، يمكن اعتبار أن تتكون من أربع مراحل متميزة: (ط) من الهجرة البالعات إلى موقع حيث توجد الكائنات الممرضة، (الثاني) الاعتراف الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) من خلال نمط مستقبلات الاعتراف (PRRs)، (الثالث) من الكائنات الحية الدقيقة الإحاطة منضمة إلى غشاء الخلية بلعمية، و (رابعا) من الخلايا المعالجة اجتاحت داخل phagosomes النضج والهضم للجسيمات بلعها. تقييم الدراسات التي البلعمة في مجملها هي برامج إعلامية 1، 2، 3، 4، 5 لكنها محدودة من حيث أنها لا كسر عادة أسفل إلى عملية الابتلاع، والهجرة ونضوج يبلوع، والتي قد تتأثر بشكل مختلف. وعلاوة على ذلك، مثل هذه الدراسات تقييم امتصاص كحدث واحد، بدلا من أن تكون عملية ديناميكية مستمرة. وقد وضعنا مؤخرا المتقدمة تقنيات التصوير الخلية الحية، وتضافرت هذه مع التحليل الوظيفي لكلا الوراثيةالممرض والمضيف الخلايا لخلق منصة متعددة التخصصات لتحليل الفطرية وظيفة الخلايا المناعية الفطرية والمرضية. وقد كشفت هذه الدراسات جوانب من رواية البلعمة أنه لا يمكن ملاحظتها باستخدام التحليل الزمني المنتظم للتفاعلات الجزيئية والخلوية بين البالعات الإنسان ومسببات الأمراض الفطرية والكائنات الدقيقة المعدية بشكل عام. على سبيل المثال، بدأنا لتحديد ما يلي: (أ) مكونات سطح الخلية المطلوبة لكل مرحلة من مراحل عملية الابتلاع، والاعتراف وقتل الخلايا الفطرية 1، 6، 7، 8، (ب) الهندسة سطح كيف يؤثر على كفاءة امتصاص البلاعم وقتل الخميرة والخلايا خوطي 7؛ و (ج) كيف الإحاطة يؤدي إلى تغيير في دورة الخلية وسلوك الضامة 9 و 10. وعلى النقيض من واحد لقطات نقطة زمنية، ويعيش خلايا المجهري الفيديو تمكن مجموعة واسعة من الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض التي يتعين دراستها كما شاركntinuous متواليات على مدى فترات زمنية طويلة، وتوفير المعلومات المكانية والزمانية على مجموعة واسعة من العمليات الحيوية، بما في ذلك الهجرة الخلية، والنسخ والاتجار حويصلي. نحن هنا وصف بالتفصيل كيفية إعداد المضيف والخلايا الفطرية، وإجراء التجارب المجهري الفيديو. يمكن توفير هذه الأساليب من قبل المستخدم دليل للدراسات المستقبلية مع البالعات الأخرى والكائنات الحية الدقيقة.

هنا نعرض النتائج ممثل عن C. البيض امتصاص بواسطة خط الخلية الفئران البلاعم J774.1 خلال 6 ساعة الخلية الحية فيديو التجربة المجهري. الرقم 1 هو ممثل المجهري لقطات فيديو حية خلايا الفيلم، والتي تبين من البلعمة C. البيض من قبل الضامة J774.1 الفئران. الخلية الحية المجهري الفيديو تمكن من استيعاب C. البيض لتكون تصور من دون الحاجة إلى وصمة عار المبيضات الخارجية، ولكن خلال هذه التجارب، C. كانت ملطخة البيض باستخدام الصبغة درجة الحموضة حساسة FITC (الخضراء)، التي تطفئ خلال تحمض من يبلوع البلاعم، ويسهل تأكيد أنه تم المنضوية المبيضات (الشكل 1). لمزيد من المساعدات التصور C. بلعها كانت ملطخة البيض، الضامة باستخدام صبغة الفلورسنت الأحمر LysoTracker الأحمر DND-99، والتي البقع الحمضية وحجرات بمثابة علامة غير محددة من النضج يبلوع.الرقم 2 هو صورة ثابتة من تجربة الفيديو الحية المجهري خلايا ويوضح الاختلاف في عدد C. تناولها من قبل البيض الضامة J774.1 الفردية. في هذه التجربة، اجتاحت 82٪ من J774.1 الضامة واحد على الأقل C. البيض الخلية في نهاية الفحص البلعمة 6 ساعة. في، 3 الشكل عدد C. المنضوية وتفيد التقارير البيض خلايا البلاعم في. متوسط ​​عدد C. تناول البيض في البلاعم هو 3.4، ولكن المثير للاهتمام الضامة يمكن استيعاب ما يصل إلى 16 الخلايا الفطرية. الشكل 4 هو سلسلة من الصور الثابتة من ممثل الخلية الحية فيديو التجربة المجهري يظهر البلاعم phagocytosing C. البيض الخلايا، خوط النمو مع البلاعم البلاعم وتحلل في نهاية المطاف. الشكل 4 يوضح أن المجهري الفيديو تمكن من تحليل الأحداث التالية الإحاطة من الخلايا المستهدفة، يمكن إنشاء أي بيانات لكيlling من قبل الضامة C. البيض خيوط فيما يتعلق بعدد والتشكل من الخلايا المستهدفة بلعها، وكيف قتل البلاعم يتعلق النضج يبلوع التي يمكن دراستها في الوقت الحقيقي. الشكل 1. لايف خلايا فيلم فيديو يظهر الفحص المجهري البلعمة من C. البيض من قبل الضامة J774.1 الفئران. هي ملطخة الضامة باستخدام صبغة الفلورسنت الأحمر LysoTracker الأحمر DND-99، وC. هي ملطخة FITC باستخدام البيض (الخضراء). الضامة وC. وشارك في تربيتها البيض لمدة من 6 ساعة عند C ° 37 في CO 2-كاملة مستقلة المتوسط. تم التقاط الصور على فترات لمدة 6 دقيقة 1 ساعة. ويمكن رؤية الضامة إنشاء خلية اتصال مع خلايا C. البيض، والذي يليه ثم امتصاص C. البيض في phagosomes البلاعم. الأسهم تشير إلى C. البيض قبل الإحاطة التي كتبها J774.1 الضامة. هذا الفيديو يبين لنا أيضا أن مضان FITC هو quenc[هد] الإحاطة التالية C. البيض. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> الشكل 2. المجهري الممثل لقطات فيديو حية خلايا تباين صورة ثابتة تظهر في عدد من كانديدا البيكانز اجتاحت الضامة الفردية. والضامة (الملون باستخدام LysoTracker الأحمر DND-99) شارك في تربيتها مع FITC الملطخة C. البيض (الخضراء). هناك تفاوت في عدد C. اجتاحت البيض (عدد القادم إلى سهم يشير إلى عدد البيض C. اجتاحت)، وفي C. البيض مورفولوجيا (أي الآيات الخميرة خوط). شريط النطاق، 20 ميكرومتر. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> الشكل 3. الرسم البياني يوضح عدد C. بلعها البيض في الفئران البلاعم J774.1 في نهاية المقايسات البلعمة من 6 ساعة. البيانات تمثل 2 تجارب مستقلة. تم إحصاء ما مجموعه 100 الضامة من 3 حقول من كل تجربة، وإعطاء ما مجموعه 600 الضامة الفردية. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> الشكل 4. سلسلة من الصور من ممثل الخلية الحية فيديو التجربة المجهري يظهر البلاعم (M) وC. البيض (C) قبل وأثناء الاعتراف (A، B)، وأثناء وبعد امتصاص (C، D). C. البيض خيوط تستمر في النمو داخل البلاعم (E، F)، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحلل البلاعم (G). ويتم تجنيد الضامة الأخرى إلى موقع تمزق ومحاولة لاستيعاب C. صدر البيض (H). هي ملطخة الضامة باستخدام الصبغة الحمراء الفلورسنت LysoTracكير الأحمر DND-99، وC. هي ملطخة FITC باستخدام البيض (الخضراء). ملاحظة أن تطفئ تلطيخ FITC بعد C. البيض امتصاص J774.1 الضامة (C). شريط النطاق، 10 ميكرومتر.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis at JoVE.com

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من خلايا<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; البلعمة من قبل الضامة. هذه الأساليب تمكن مرحلة محددة تحليل للهجرة البلاعم، والاعتراف، والإحاطة النضج يبلوع وتكشف عن جوانب جديدة من البلعمة.

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.7K Views.  University of Aberdeen. وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من خلايا المبيضات البيض البلعمة من قبل الضامة. هذه الأساليب تمكن مرحلة محددة تحليل للهجرة البلاعم، والاعتراف، والإحاطة النضج يبلوع وتكشف عن جوانب جديدة من البلعمة.

Video: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

تصوير الخلايا الحية من الهربسي الألفائي الفيروسات النقل تقدمي وانتشارها

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

متساوي التضخيم (LAMP) فحوصات بوساطة حلقة للكشف عن أنواع محددة من<em&gt; الأيمرية</em&gt; التي تصيب الدجاج

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.