يمكن أن تؤكد هذه الطريقة قدرة تشكيل الجهازية لظهارة السيلي التخلص من التمييز التي تكتسب علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي. يتم تنفيذ جمع الزغب عن طريق كشط بدلا من طريقة EDTA chelation منع الخسارة الكاملة للميسينشيم الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة إذا لزم الأمر لبدء organoid. تنطبق هذه الطريقة في الأنسجة الظهارية حيث يتم تحديد المقصورات التكاثرية والمتمايزة جسديا وتعبر الخلايا المزيلة للتمييز عن علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي.
بعض العوامل في هذا البروتوكول تحتاج إلى تحديد تجريبي، بما في ذلك المرحلة المثلى لحصاد الزغب والضغط الأمثل للتخلص من الزغب، الأمر الذي سيستغرق وقتا وممارسة. حث Smad4 بالضربة القاضية والحصول على بيتا كاتينين من طفرة وظيفة في الفئران المتحولة مع الحقن داخل الصفاق من تاموكسيفين وزيت الذرة لمدة أربعة أيام متتالية. بعد القتل الرحيم للفأر، رش البطن مع 70٪ الإيثانول لمنع فرو الماوس من الدخول في تجويف الصفاق.
افتح تجويف البطن بمقص تشريح لكشف الأمعاء وعزل الأمعاء باستخدام مقص ومملقط. تشريح النصف القريب من الاثني عشر، ثم طرد الاثني عشر مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS في حقنة 10 ملليلتر لمسح المحتوى الإنارة. فتح duodenum طوليا مع مقص الزاوية ووضع شقة الاثني عشر على طبق بيتري 15 سنتيمترا على الجليد مع تجويف الاثني عشر التي تواجه المشغل.
قبل البدء في كشط، ضع مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في واحدة من آبار لوحة زراعة الأنسجة من ستة آبار. ملء جميع الآبار مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X ووضع لوحة على الجليد. كشط الزغب باستخدام اثنين من الشرائح الزجاجية المجهرية، واحدة لعقد الاثني عشر إلى أسفل والآخر لكشط.
كشط الجانب الإنارة من الاثني عشر سطحيا مرتين لإزالة المخاط دون إزالة الزغب، ثم كشط الاثني عشر مرتين أخريين لجمع الزغب على الشرائح دون ربط سرداب. استخدام ماصة نقل ملليلتر واحد يحتوي على برنامج تلفزيوني لنقل الزغب إلى مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في طبق من ستة آبار. جمع الزغب بعد كل كشط.
لإزالة سرداب فضفاضة، وغسل الزغب التي تم جمعها مع مصفاة 70 ميكرومتر عن طريق نقل مصفاة من خلال سلسلة من الآبار في طبق من ستة آبار تحتوي على أربعة ملليلتر من الجليد البارد PBS لكل بئر. باستخدام ماصة P1000، نقل تعليق الزغب في حوالي ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني من مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر على الجليد. استخدام 0.1٪ BSA المغلفة حادة انتهت P200 تلميح ماصة لنقل حجم 50 ميكرولتر من تعليق زغب على شريحة زجاجية.
عد عدد الزغب في قطرة 50 ميكرولتر تحت التكبير 4X لتحديد تركيز الزغب في تعليق برنامج تلفزيوني وتأكيد عدم وجود سرداب مربوطة. للوحة الزغب، استخدم 0.1٪ BSA المغلفة P200 طرف ماصة حادة النهاية لنقل الزغب إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق لكثافة الطلاء من ستة زغب لكل بئر في 12.5 ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. تدور أسفل الزغب لمدة دقيقتين في 200 مرة G في أربع درجات مئوية.
إزالة supernatant وتكرار الطرد المركزي لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية. في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، resuspend بيليه الزغب بلطف في الكمية المطلوبة من BME-R1 الباردة إذابة على الجليد. باستخدام ماصة P20، لوحة 12.5 ميكرولتر من الزغب في مصفوفة BME-R1 لكل بئر من لوحة U-bottomed جيدا 96 جيدا قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بتقويم مصفوفة BME-R1. إضافة إلى كل بئر، إضافة 125 ميكرولتر من وسائل الإعلام ENR قبل الحارة تكمل كما هو موضح في المخطوطة النصية. احتضان الزغب المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين.
تجاهل أي بئر تظهر فيه العضيات قبل يومين. هناك فرق في مظهر الأجهزة الناشئة من السراديب مقابل ظهارة السيلي غير المتمايزة من نفس أمعاء الماوس. تظهر الأجهزة العضوية المشتقة من سرداب بين عشية وضحاها كهياكل كروية ذات حدود محددة جيدا.
تم فحص الحركية والمظهر المورفولوجي للأعضاء التي بدأت من الزغب ، والتي تظهر على شكل غير منتظم في البداية و تستغرق يومين إلى خمسة أيام قبل أن يمكن رؤيتها تحت المجهر. يظهر بدء العضوية من اثنين من زغب مختلفة. يبدو الزغب مع إمكانية تشكيل الجهاز كثيفة، وربما يرجع ذلك إلى الاحتفاظ mesenchyme الكامنة.
بدء Organoid من الفيلات هو واضح في اليوم الثاني من واحدة من الزغب. بينما في الفيلات الأخرى، يظهر الجهاز في اليوم الرابع. من المهم اتخاذ الخطوات المناسبة لتجنب التلوث سرداب عند حصاد الزغب وزراعة الأجهزة الناتجة.
لوحظت اختلافات فينوتبيك بين الأجهزة الناشئة من السراديب والسخافات من نفس المتحولة بعد هذا الإجراء ، لذلك يمكن إجراء المزيد من التجارب للبحث عن الاختلافات الجزيئية بين الاثنين. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الاختلافات بين الأجهزة الناشئة عن السراديب الذاتية مقابل السراديب خارج الرحم الناشئة عن إزالة التمايز، وبالتالي يمكن معالجة الآثار المترتبة على إزالة التمايز.
