Cette méthode peut confirmer la capacité de formation d’organoïdes de dédéliférer l’épithélium des villosités qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. La collecte des villosités est effectuée par grattage plutôt que par la méthode de chélation EDTA empêchant la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche si nécessaire pour l’initiation organoïde. Cette méthode est applicable dans les tissus épithéliaux où les compartiments prolifératifs et différenciés sont physiquement délimités et où les cellules démilinciantes expriment des marqueurs de cellules souches in vivo.
Certains facteurs de ce protocole doivent être déterminés empiriquement, y compris l’étape optimale pour la récolte des villosités et la pression optimale pour gratter les villosités, ce qui prendra du temps et de la pratique. Induire le knockout Smad4 et le gain de fonction de la bêta-caténine chez des souris mutantes avec injection intrapéritonéale de tamoxifène et d’huile de maïs pendant quatre jours consécutifs. Après avoir euthanasié la souris, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure de la souris de pénétrer dans la cavité péritonéale.
Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux à dissection pour exposer l’intestin et isolez l’intestin à l’aide de ciseaux et de pinces. Disséquez la moitié proximale du duodénum, puis rincez le duodénum avec cinq millilitres de PBS glacé dans une seringue de 10 millilitres pour éliminer le contenu luminal. Ouvrez le duodénum longitudinalement avec un ciseau incliné et posez le duodénum à plat sur une boîte de Petri de 15 centimètres sur de la glace avec la lumière du duodénum face à l’opérateur.
Avant de commencer le raclage, placez une passoire à mailles de 70 micromètres dans l’un des puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Remplissez tous les puits avec quatre millilitres de PBS 1X et placez la plaque sur de la glace. Grattez les villosités à l’aide de deux lames de verre microscopiques, l’une pour maintenir le duodénum vers le bas et l’autre pour gratter.
Gratter le côté luminal du duodénum superficiellement deux fois pour enlever le mucus sans enlever les villosités, puis gratter le duodénum deux fois de plus pour recueillir les villosités sur les diapositives sans attacher les cryptes. Utilisez une pipette de transfert d’un millilitre contenant du PBS pour transférer les villosités vers une passoire maillée de 70 micromètres dans la parabole à six puits. Ramassez les villosités après chaque éraflure.
Pour éliminer les cryptes lâches, lavez les villosités recueillies avec la passoire de 70 micromètres en transférant la passoire à travers une série de puits dans la boîte de six puits contenant quatre millilitres de PBS glacé par puits. À l’aide d’une pipette P1000, transférez la suspension de villosités dans environ trois millilitres de PBS de la crépine de 70 micromètres vers un nouveau tube de 15 millilitres sur glace. Utilisez une pointe de pipette P200 à 0,1 % revêtue de BSA pour transférer un volume de 50 microlitres de la suspension à villosités sur une glissière en verre.
Comptez le nombre de villosités dans la gouttelette de 50 microlitres sous grossissement 4X pour déterminer la concentration de villosités dans la suspension PBS et pour confirmer l’absence de cryptes attachées. Pour plaquer les villosités, utilisez une pointe de pipette à extrémité émoussée P200 revêtue de 0,1 % de BSA pour transférer les villosités dans un tube de microcentrifugation pour une densité de placage de six villosités par puits dans 12,5 microlitres de matrice BME-R1. Faites tourner les villosités pendant deux minutes à 200 fois G à quatre degrés Celsius.
Retirez le surnageant et répétez la centrifugation pour éliminer tout PBS résiduel. Dans une hotte à écoulement laminaire, remettez ensemisement doucement la pastille dans la quantité requise de BME-R1 froid décongelé sur de la glace. À l’aide d’une pipette P20, plaque 12,5 microlitres des villosités dans la matrice BME-R1 par puits d’une plaque à fond en U de 96 puits préchauffée à 37 degrés Celsius.
Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la solidification de la matrice BME-R1. À chaque puits, ajoutez 125 microlitres de supports ENR préchauffés complétés comme décrit dans le manuscrit textuel. Incuber les villosités plaquées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et changer le milieu tous les deux jours.
Jetez tout puits dans lequel les organoïdes apparaissent avant deux jours. Il y a une différence dans l’apparence des organoïdes émergeant des cryptes par rapport à l’épithélium des villosités déconiffé différencié du même intestin de souris. Les organoïdes dérivés de la crypte apparaissent du jour au lendemain comme des structures sphériques avec des bordures bien définies.
La cinétique et l’aspect morphologique des organoïdes initiés à partir des villosités ont été examinés, qui semblent de forme irrégulière au début et prennent de deux à cinq jours avant de pouvoir être vus au microscope. L’initiation organoïde à partir de deux villosités différentes est montrée. Les villosités ayant un potentiel de formation organoïde semblent denses, peut-être en raison de la rétention du mésenchyme sous-jacent.
L’initiation organoïde des villas est apparente au deuxième jour depuis l’un des villosités. Alors que dans les autres villas, l’organoïde apparaît au quatrième jour. Il est crucial de prendre les mesures appropriées pour éviter la contamination des cryptes lors du prélèvement des villosités et de la croissance des organoïdes qui en résultent.
Des différences phénotypiques entre les organoïdes émergeant des cryptes et des villosités du même mutant ont été observées à la suite de cette procédure, de sorte que d’autres expériences ont pu être menées pour rechercher des différences moléculaires entre les deux. Ce protocole pourrait être utilisé pour étudier les différences entre les organoïdes issus des cryptes endogènes et les cryptes ectopiques résultant de la dédifférenciation, de sorte que les implications de la dédifférenciation pourraient être abordées.
