Este método pode confirmar a capacidade de formação organoide do epitélio villi deseferentes que adquirem marcadores de células-tronco in vivo. A coleta de villi é realizada através de raspagem em vez do método de quelação EDTA impedindo a perda completa do mesenquime subjacente que pode fornecer os sinais de nicho, se necessário para a iniciação organoide. Este método é aplicável em tecidos epiteliais onde compartimentos proliferativos e diferenciados são fisicamente delineados e as células deseferimento expressam marcadores de células-tronco in vivo.
Alguns fatores neste protocolo precisam ser determinados empiricamente, incluindo o estágio ideal para a colheita do villi e a pressão ideal para raspar o villi, o que levará tempo e prática. Induzir o nocaute de Smad4 e o ganho beta-catenin da mutação da função em camundongos mutantes com injeção intraperitoneal de tamoxifen e óleo de milho por quatro dias consecutivos. Depois de eutanásia do camundongo, pulverize o abdômen com 70% de etanol para evitar que o pelo do rato entre na cavidade peritoneal.
Abra a cavidade abdominal com a tesoura de dissecção para expor o intestino e isolar o intestino usando tesouras e fórceps. Disseque a metade proximal do duodeno, em seguida, lave o duodeno com cinco mililitros de PBS gelado em uma seringa de 10 mililitros para limpar o conteúdo luminal. Abra o duodeno longitudinalmente com uma tesoura angular e coloque o duodeno plano em uma placa de Petri de 15 centímetros no gelo com o lúmen do duodeno de frente para o operador.
Antes de começar a raspagem, coloque um coador de malha de 70 micrômetros em um dos poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Encha todos os poços com quatro mililitros de 1X PBS e coloque a placa no gelo. Raspe o villi usando dois slides de vidro microscópicos, um para segurar o duodeno para baixo e o outro para raspar.
Raspe o lado luminal do duodeno superficialmente duas vezes para remover o muco sem remover o villi, em seguida, raspe o duodeno mais duas vezes para coletar o villi nos slides sem amarrar as criptas. Use uma pipeta de transferência de um mililitro contendo PBS para transferir o villi para um coador de malha de 70 micrômetros no prato de seis poços. Pegue o villi depois de cada arranhão.
Para remover criptas soltas, lave o villi coletado com o coador de 70 micrômetros transferindo o coador através de uma série de poços no prato de seis poços contendo quatro mililitros de PBS gelado por poço. Usando uma pipeta P1000, transfira a suspensão villi em cerca de três mililitros de PBS do coador de 70 micrômetros para um novo tubo de 15 mililitros no gelo. Use uma ponta de pipeta P200 revestida com 0,1% BSA para transferir um volume de 50 microliter da suspensão villi em uma lâmina de vidro.
Conte o número de villi na gotícula de 50 microliter sob ampliação 4X para determinar a concentração de villi na suspensão pbs e para confirmar a ausência de criptas amarradas. Para emplacar o villi, use uma ponta de pipeta P200 revestida com BSA de 0,1% para transferir o villi para um tubo de microcentrifuuge para uma densidade de revestimento de seis villi por poço em 12,5 microliters de matriz BME-R1. Gire o villi por dois minutos a 200 vezes G a quatro graus Celsius.
Remova o sobrenatante e repita a centrifugação para remover qualquer PBS residual. Em um capô de fluxo laminar, resuspenque a pelota de villi suavemente na quantidade necessária de BME-R1 frio descongelado no gelo. Usando uma pipeta P20, placa 12,5 microliters do villi na matriz BME-R1 por poço de uma placa de 96 poços com fundo U pré-aquecida a 37 graus Celsius.
Incubar a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a solidificação da matriz BME-R1. A cada poço, adicione 125 microliters de mídia ENR pré-aquecida suplementada conforme descrito no manuscrito do texto. Incubar o villi banhado em uma incubadora de cultura de tecido a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e mudar a mídia a cada dois dias.
Descarte qualquer poço em que organoides apareçam antes de dois dias. Há uma diferença na aparência dos organoides emergindo das criptas versus o epitélio villi dese diferenciado do mesmo intestino do rato. Os organoides derivados da cripta aparecem da noite para o dia como estruturas esféricas com bordas bem definidas.
A cinética e a aparência morfológica dos organoides iniciados a partir de villi foram examinadas, que aparecem irregularmente moldadas no início e levam de dois a cinco dias antes de serem vistas sob um microscópio. A iniciação organoide de dois villi diferentes é mostrada. O villi com potencial de formação organoide parece denso, possivelmente devido à retenção do mesenquime subjacente.
A iniciação organoide das vilas é aparente no segundo dia de um dos villi. Enquanto nas outras vilas, o organoide aparece no quarto dia. É crucial tomar as medidas adequadas para evitar a contaminação por cripta ao colher os villi e cultivar os organoides resultantes.
Diferenças fenotípicas entre os organoides emergindo das criptas e villi do mesmo mutante foram observadas após este procedimento, de modo que mais experimentações poderiam ser realizadas para procurar diferenças moleculares entre os dois. Este protocolo poderia ser usado para estudar as diferenças entre organoides decorrentes de criptas endógenas versus criptas ectópicas decorrentes da deseferibrência, assim, implicações de deseferibrência poderiam ser abordadas.
