Этот метод может подтвердить органообразующую способность дедифференцирующего эпителия ворсинок, которые приобретают маркеры стволовых клеток in vivo. Сбор ворсинок осуществляется с помощью соскоба, а не метода хелатирования ЭДТА, предотвращающего полную потерю основного мезенхима, который может обеспечить нишевые сигналы, если это необходимо для органоидной инициации. Этот метод применим в эпителиальных тканях, где пролиферативные и дифференцированные компартменты физически очерчены, а дедифференцированные клетки экспрессируют маркеры стволовых клеток in vivo.
Некоторые факторы в этом протоколе должны быть определены эмпирически, включая оптимальный этап сбора ворсинок и оптимальное давление для соскабливания ворсинок, что потребует времени и практики. Индуцировать нокаут Smad4 и бета-катенин усиления мутации функции у мутантных мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции тамоксифена и кукурузного масла в течение четырех дней подряд. После усыплении мыши опрыскайте брюшко 70% этанолом, чтобы предотвратить попадание шерсти мыши в брюшную полость.
Откройте брюшную полость с помощью рассеченных ножниц, чтобы обнажить кишечник и изолировать кишечник с помощью ножниц и щипцов. Рассеките проксимальную половину двенадцатиперстной кишки, затем промыть двенадцатиперстную кишки пятью миллилитрами ледяного PBS в 10-миллилитровом шприце, чтобы очистить просветное содержимое. Откройте двенадцатиперстную кишки продольно угловыми ножницами и уложите двенадцатиперстную кишки плоско на 15-сантиметровую чашку Петри на льду просветом двенадцатиперстной кишки лицом оператора.
Перед началом выскабливания поместите 70-микрометровый сетчатый сетчатый сетчатый фильтр в одну из скважин пластины для культивирования тканей с шестью скважинами. Заполните все колодцы четырьмя миллилитрами 1X PBS и поместите пластину на лед. Соскоблите ворсинки, используя два микроскопических стеклянных слайда, один для удержания двенадцатиперстной кишки вниз, а другой для царапины.
Соскоблите просветную сторону двенадцатиперстной кишки поверхностно дважды, чтобы удалить слизь, не удаляя ворсинки, затем соскоблите двенадцатиперстную кисть еще два раза, чтобы собрать ворсинки на слайдах, не привязывая крипты. Используйте переносную пипетку в один миллилитр, содержащую PBS, чтобы перенести ворсинки на 70-микрометровый сетчатый сетчатый фильтр в тарелке с шестью лунками. Собирайте ворсинки после каждого соскоба.
Чтобы удалить рыхлые крипты, промыть ворсинки, собранные с помощью 70-микрометрового сетчатого фильтра, передавая сетчатый фильтр через серию скважин в шестискважниковой посуде, содержащей четыре миллилитра ледяного холода PBS на скважину. Используя пипетку P1000, перенесите суспензию ворсинок примерно в трех миллилитрах PBS с 70-микрометрового сетчатого фильтра в новую 15-миллилитровую трубку на льду. Используйте тупой наконечник пипетки P200 с покрытием BSA 0,1%, чтобы перенести 50-микролитровой объем суспензии ворсинок на стеклянный слайд.
Подсчитайте количество ворсинок в 50 микролитрах капельки под 4-кратным увеличением, чтобы определить концентрацию ворсинок в суспензии PBS и подтвердить отсутствие привязанных крипт. Чтобы покрыть ворсинки, используйте тупой наконечник пипетки P200 с покрытием BSA для переноса ворсинок в трубку микроцентрифуги для плотности покрытия шести ворсинок на лунку в 12,5 микролитрах матрицы BME-R1. Вращайте ворсинки в течение двух минут в 200 раз G при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант и повторите центрифугирование, чтобы удалить все остатки PBS. В ламинарной вытяжке аккуратно повторно суспендируйте гранулу ворсинок в необходимом количестве холодного BME-R1, размороженный на льду. Используя пипетку P20, пластина 12,5 микролитров ворсинок в матрице BME-R1 на лунку 96-луночной U-донной пластины предварительно нагретой до 37 градусов Цельсия.
Инкубировать пластину в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы обеспечить затвердевания матрицы BME-R1. К каждой лунки добавляют 125 микролитров предварительно нагретых сред ENR, дополненных, как описано в текстовой рукописи. Инкубируют покрытые ворсинки в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом и меняют жижи через день.
Отбросьте любой колодец, в котором органоиды появляются до двух дней. Существует разница во внешнем виде органоидов, выходящих из крипт, по сравнению с дедифференцированным эпителием ворсинок из той же мышиной кишки. Органоиды, полученные из крипты, появляются в одночасье в виде сферических структур с четко определенными границами.
Была изучена кинетика и морфологический вид органоидов, инициированных из ворсинок, которые сначала кажутся неправильной формы и занимают от двух до пяти дней, прежде чем их можно будет увидеть под микроскопом. Показано органоидное инициация из двух разных ворсинок. Ворсинки с органообразующим потенциалом кажутся плотными, возможно, из-за удержания нижележащей мезенхимы.
Органоидное посвящение из вилл проявляется на второй день из одной из ворсинок. В то время как на других виллах органоид появляется на четвертый день. Крайне важно предпринять правильные шаги, чтобы избежать загрязнения крипты при сборе ворсинок и выращивании полученных органоидов.
Фенотипические различия между органоидами, возникающими из крипт и ворсинок одного и того же мутанта, наблюдались после этой процедуры, поэтому можно было провести дальнейшие эксперименты для поиска молекулярных различий между ними. Этот протокол может быть использован для изучения различий между органоидами, возникающими из эндогенных крипт, и эктопическими криптами, возникающими в результате дедифференцировки, таким образом, могут быть рассмотрены последствия дедифференцировки.
