この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する脱分化ビリ上皮のオルガノイド形成能を確認できる。絨毛の収集は、オルガノイド開始に必要な場合にニッチ信号を提供し得る根底の間分関係の完全な損失を防ぐEDTAキレート法ではなく、擦り傷を介して行われる。この方法は、増殖および分化された区画が物理的に線引きされ、脱分化細胞が生体内で幹細胞マーカーを発現する上皮組織に適用可能である。
このプロトコルのいくつかの要因は、絨毛を収穫するための最適な段階と、時間と練習を要する絨毛を削るための最適な圧力を含め、経験的に決定する必要があります。4日間連続してタモキシフェンとトウモロコシ油の腹腔内注射を行った変異マウスの機能変異のSmad4ノックアウトおよびβ-カテニンのゲインを誘導する。マウスを安楽死させた後、腹部に70%エタノールを吹き付けて、マウスの毛皮が腹腔に入るのを防ぎます。
解剖はさみで腹腔を開いて腸を露出させ、はさみと鉗子を使って腸を単離する。十二指腸の近位半分を解剖し、その後、10ミリリットルの注射器で氷冷PBSの5ミリリットルで十二指腸を洗い流し、発光含有量をクリアする。斜めのはさみで縦方向に十二指腸を開き、十二指腸の内腔がオペレータに向いている氷の上に15センチメートルのペトリ皿の上に平らに十二指腸を置きます。
削り始める前に、6ウェル組織培養プレートのウェルの1つに70マイクロメートルのメッシュストレーナーを置きます。すべての井戸を1X PBSの4ミリリットルで満たし、プレートを氷の上に置きます。2つの顕微鏡的なガラススライドを使用して絨毛を削り、1つは十二指腸を下に保持し、もう1つは擦り傷を付けます。
十二指腸の明るい側を表面的に2回削り、絨毛を取り除かずに粘液を取り除き、十二指腸をさらに2回削り、納骨堂をテザリングすることなくスライド上の絨毛を収集する。PBSを含む1ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、6ウェル皿の70マイクロメートルメッシュストレーナーに絨毛を移します。すべての擦り傷の後に絨毛を収集します。
緩い納骨堂を取り除くために、1ウェルあたり4ミリリットルの氷冷PBSを含む6ウェル皿の一連の井戸を通してストレーナーを移すことによって、70マイクロメートルのストレーナーで収集した絨毛を洗います。P1000ピペットを使用して、70マイクロメートルストレーナーから氷上の新しい15ミリリットルチューブにPBSの約3ミリリットルで絨毛懸濁液を移します。0.1%BSAコーティングの鈍い終わりP200ピペットの先端を使用して、絨毛懸濁液の50マイクロリットルの体積をガラススライドに移します。
4X倍率の50マイクロリットルの液滴中の絨毛の数を数えて、PBS懸濁液中の絨毛の濃度を決定し、つながれた納骨堂の欠如を確認する。絨毛をプレートするには、0.1%BSAコーティングP200鈍エンドピペットチップを使用して、BME-R1マトリックスの12.5マイクロリットルで6絨毛のメッキ密度のためにマイクロ遠心チューブに絨毛を移します。4°Cで200倍Gで2分間ビリをスピンダウンします。
上清を取り除き、遠心分離を繰り返して残留PBSを除去します。ラミナールフローフードで、氷の上で解凍した冷たいBME-R1の必要量にそっと絨毛ペレットを再懸濁します。P20ピペットを使用して、BME-R1マトリックスの絨毛のプレート12.5マイクロリットルを摂氏37度に予め温めた96ウェルU底板のウェルあたり。
BME-R1マトリックスを固化できるように、37°Cの組織培養インキュベーターで15分間プレートをインキュベートします。各井戸に、テキスト原稿に記載されているように補足される125マイクロリットルの温め前のENR培地を加える。5%の二酸化炭素で摂氏37度の組織培養インキュベーターにめっき絨毛をインキュベートし、一日おきに培地を交換します。
オルガノイドが2日前に現れる井戸を捨てる。同じマウス腸から脱分化された絨毛上皮と陰窩から出現するオルガノイドの外観に違いがある。暗号由来オルガノイドは、明確に定義された境界を持つ球状の構造として一晩現れる。
絨毛から始まったオルガノイドの運動学的および形態学的外観を調べ、最初は不規則な形で見え、顕微鏡下で見られるまでに2〜5日かかる。2つの異なる絨毛からのオルガノイド開始が示されている。オルガノイド形成電位を有する絨毛は、おそらく基礎となる間質の保持のために、緻密に見える。
ヴィラからのオルガノイド開始は、絨毛の1つから2日目に明らかです。他のヴィラにいる間、オルガノイドは4日目に現れます。絨毛を収穫し、得られたオルガノイドを成長させるときには、暗号汚染を避けるために適切な措置を講じる必要があります。
同じ変異体の暗号と絨毛から出現するオルガノイドとの間に生まれる有機体の間のフェノイドの違いは、この手順に従って観察されたので、両者の分子差を探すためにさらなる実験を行うことができる。このプロトコルは、分化解除から生じる内在性の暗号と異所性の納骨堂から生じるオルガノイドの違いを研究するために使用することができ、したがって、脱分化の影響に対処することができる。
