Este método puede confirmar la capacidad formadora de organoides del epitelio de vellosidades desdes diferenciadoras que adquieren marcadores de células madre in vivo. La recolección de vellosidades se realiza mediante raspado en lugar del método de quelación EDTA que previene la pérdida completa del mesénquima subyacente que puede proporcionar las señales de nicho si es necesario para la iniciación organoide. Este método es aplicable en tejidos epiteliales donde los compartimentos proliferativos y diferenciados están físicamente delineados y las células desdes diferenciadoras expresan marcadores de células madre in vivo.
Algunos factores en este protocolo deben determinarse empíricamente, incluida la etapa óptima para cosechar las vellosidades y la presión óptima para raspar las vellosidades, lo que llevará tiempo y práctica. Inducir la mutación Smad4 knockout y beta-catenina de ganancia de función en ratones mutantes con inyección intraperitoneal de tamoxifeno y aceite de maíz durante cuatro días consecutivos. Después de la eutanasia del ratón, rocíe el abdomen con 70% de etanol para evitar que el pelaje del ratón entre en la cavidad peritoneal.
Abra la cavidad abdominal con tijeras de disección para exponer el intestino y aislar el intestino con tijeras y pórceps. Diseccionar la mitad proximal del duodeno, luego enjuagar el duodeno con cinco mililitros de PBS helado en una jeringa de 10 mililitros para eliminar el contenido luminal. Abra el duodeno longitudinalmente con una tijera en ángulo y coloca el duodeno plano sobre una placa de Petri de 15 centímetros sobre hielo con la luz del duodeno mirando hacia el operador.
Antes de comenzar el raspado, coloque un colador de malla de 70 micrómetros en uno de los pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos. Llene todos los pozos con cuatro mililitros de 1X PBS y coloque la placa sobre hielo. Raspe las vellosidades usando dos portaobjetos de vidrio microscópicos, uno para sostener el duodeno hacia abajo y el otro para raspar.
Raspe el lado luminal del duodeno superficialmente dos veces para eliminar el moco sin eliminar las vellosidades, luego raspe el duodeno dos veces más para recoger las vellosidades en las diapositivas sin atar las criptas. Use una pipeta de transferencia de un mililitro que contenga PBS para transferir las vellosidades a un colador de malla de 70 micrómetros en el plato de seis pozos. Recoge las vellosidades después de cada rasguño.
Para eliminar las criptas sueltas, lave las vellosidades recolectadas con el colador de 70 micrómetros transfiriendo el colador a través de una serie de pozos en el plato de seis pozos que contiene cuatro mililitros de PBS helado por pozo. Usando una pipeta P1000, transfiera la suspensión de vellosidades en aproximadamente tres mililitros de PBS del colador de 70 micrómetros a un nuevo tubo de 15 mililitros sobre hielo. Utilice una punta de pipeta P200 de extremo romo recubierta de BSA al 0,1% para transferir un volumen de 50 microlitros de la suspensión de vellosidades a un portaobjetos de vidrio.
Cuente el número de vellosidades en la gota de 50 microlitros con un aumento de 4X para determinar la concentración de vellosidades en la suspensión de PBS y confirmar la ausencia de criptas atadas. Para colocar las vellosidades, use una punta de pipeta de extremo romo P200 recubierta de BSA al 0.1% para transferir las vellosidades a un tubo de microcentrífuga para una densidad de recubrimiento de seis vellosidades por pozo en 12.5 microlitros de matriz BME-R1. Gire hacia abajo las vellosidades durante dos minutos a 200 veces G a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y repita la centrifugación para eliminar cualquier PBS residual. En una campana de flujo laminar, vuelva a colocar el pellet de vellosidades suavemente en la cantidad requerida de BME-R1 frío descongelado en hielo. Usando una pipeta P20, placa 12.5 microlitros de las vellosidades en matriz BME-R1 por pozo de una placa con fondo en U de 96 pozos precalentada a 37 grados Celsius.
Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante 15 minutos para permitir la solidificación de la matriz BME-R1. A cada pozo, agregue 125 microlitros de medios ENR precalentados complementados como se describe en el manuscrito de texto. Incubar las vellosidades chapadas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y cambiar los medios cada dos días.
Deseche cualquier pozo en el que aparezcan organoides antes de dos días. Hay una diferencia en la apariencia de los organoides que emergen de las criptas frente al epitelio de vellosidades desdesferenciado del mismo intestino de ratón. Los organoides derivados de la cripta aparecen de la noche a la mañana como estructuras esféricas con bordes bien definidos.
Se examinó la cinética y la apariencia morfológica de los organoides iniciados a partir de vellosidades, que aparecen con forma irregular al principio y tardan de dos a cinco días antes de que puedan verse bajo un microscopio. Se muestra la iniciación organoide a partir de dos vellosidades diferentes. Las vellosidades con potencial de formación de organoides parecen densas, posiblemente debido a la retención del mesénquima subyacente.
La iniciación organoide de las villas es evidente en el segundo día desde una de las vellosidades. Mientras que en las otras villas, el organoide aparece en el cuarto día. Es crucial tomar las medidas adecuadas para evitar la contaminación de la cripta al cosechar las vellosidades y cultivar los organoides resultantes.
Las diferencias fenotípicas entre los organoides que emergen de las criptas y las vellosidades del mismo mutante se observaron después de este procedimiento, por lo que se podrían realizar más experimentos para buscar diferencias moleculares entre los dos. Este protocolo podría usarse para estudiar las diferencias entre organoides que surgen de criptas endógenas versus criptas ectópicas que surgen de la desdiferenciación, por lo que se podrían abordar las implicaciones de la desdiferenciación.
