이 방법은 생체 내에서 줄기 세포 마커를 획득하는 탈분화 빌리 상피의 오르가노이드 형성 능력을 확인할 수 있다. villi의 컬렉션은 오르가노이드 개시에 필요한 경우 틈새 신호를 제공할 수 있는 근본적인 메센키움의 완전한 손실을 방지하는 EDTA 킬레이션 방법보다는 스크레이핑을 통해 수행됩니다. 이 방법은 증식 및 분화 된 구획이 물리적으로 묘사되고 분화 세포가 생체 내에서 줄기 세포 마커를 발현하는 상피 조직에 적용됩니다.
이 프로토콜의 일부 요인은 악의적 인 수확을위한 최적의 단계와 시간과 연습이 소요되는 villi를 긁어내는 최적의 압력을 포함하여 경험적으로 결정되어야합니다. 4일 연속 타목시펜과 옥수수 오일의 복막 내 주사를 통해 돌연변이 마우스에서 함수 돌연변이의 Smad4 녹아웃 및 베타 카테닌 이득을 유도한다. 마우스를 안락사한 후 마우스 털이 복막 구멍으로 들어가는 것을 방지하기 위해 70%에탄올로 복부를 스프레이합니다.
해부 가위로 복강을 열어 내장을 노출시키고 가위와 집게를 사용하여 내장을 분리합니다. 십이지장의 근위 절반을 해부한 다음, 10 밀리리터 주사기로 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 십이지장 들을 플러시하여 발광 함량을 제거합니다. 각진 가위로 십이지장(duodenum)을 세로로 열고 15센티미터 페트리 접시에 듀오덴을 평평하게 놓고, 듀오덴의 루멘이 연산자와 마주하게 됩니다.
스크레이핑을 시작하기 전에 70 마이크로미터 메쉬 스트레이너를 6웰 조직 배양 플레이트의 우물 중 하나에 놓습니다. 1X PBS의 4 밀리리터로 모든 우물을 채우고 얼음 위에 접시를 놓습니다. 두 개의 미세한 유리 슬라이드를 사용하여 비방을 긁어, 하나는 십이지장 아래로 개최하고 다른 긁어.
십이지장의 발광면을 두 번 긁어 내어 악랄을 제거하지 않고 점액을 제거한 다음 십이지장을 두 번 더 긁어 내어 지하실을 묶지 않고 슬라이드의 비방을 수집합니다. PBS가 포함된 1밀리리터 이송 파이펫을 사용하여 6웰 접시에 70마이크로미터 메쉬 스트레이너로 빌리를 전달합니다. 긁힌 후 빌리를 수집합니다.
느슨한 토굴을 제거하려면 70 마이크로미터 여과기로 수집된 빌리를 잘 얼음 차가운 PBS 4밀리리터가 들어있는 6웰 접시에 일련의 우물을 통해 전달하여 세척합니다. P1000 파이펫을 사용하여 70 마이크로미터 스트레이너에서 얼음 위에 있는 새로운 15밀리리터 튜브로 PBS의 약 3밀리리터로 빌리 서스펜션을 전송합니다. 0.1%BSA 코팅 된 무딘 끝 P200 파이펫 팁을 사용하여 유리 슬라이드에 빌리 서스펜션의 50 마이크로 리터 볼륨을 전송합니다.
PBS 서스펜션에서 빌리의 농도를 결정하고 테더드 토굴의 부재를 확인하기 위해 4배 배율 아래 50 마이크로리터 액적에서 빌리수를 계산한다. villi를 플레이트하려면 0.1%BSA 코팅 P200 무딘 말단 파이펫 팁을 사용하여 BME-R1 매트릭스의 12.5 마이크로리터에서 웰당 6개의 담블리의 도금 밀도를 위해 악을 마이크로센트심심분리기 튜브로 이송합니다. 4도에서 200배 G에서 2분간 빌리를 내려갑니다.
상체를 제거하고 원심분리를 반복하여 잔류 PBS를 제거합니다. 라미나르 플로우 후드에서 얼음 위에 해동된 차가운 BME-R1의 요구량으로 빌리 펠릿을 부드럽게 재차 놓습니다. P20 파이펫을 사용하여 BME-R1 매트릭스의 12.5 마이크로리터를 96웰의 U-바닥 플레이트의 우물당 37°C까지 예열하였다.
BME-R1 매트릭스의 응고를 허용하기 위해 15 분 동안 37섭씨37도에서 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 각 우물에 텍스트 원고에 설명된 대로 보충된 미리 따뜻해지는 ENR 미디어의 125마이크로리터를 추가합니다. 도금 된 빌리를 37°C의 조직 배양에서 5%의 이산화탄소로 배양하고 격일로 미디어를 변경합니다.
오가노이드가 2일 전에 나타나는 우물을 버리십시오. 같은 마우스 장에서 차별화된 villi 상피대 와 지하실에서 나오는 오르가노이드의 외관에는 차이가 있습니다. 토굴 유래 오르가노이드는 테두리가 잘 정의된 구형 구조로 하룻밤 사이에 나타납니다.
사악한에서 시작된 오르가노이드의 운동및 형태학적 외관은 처음에는 불규칙하게 모양으로 나타나현미경으로 볼 수 있기까지 2~5일이 걸리는 것으로 조사되었다. 두 개의 서로 다른 빌리로부터의 오르가노이드 개시가 표시됩니다. 오르가노이드 형성 잠재력을 가진 빌리는 근본적인 관공서의 보유 때문일 가능성이 높습니다.
빌라에서 오르가노이드 개시는 빌리 중 하나에서 둘째 날에 명백하다. 다른 빌라에 있는 동안, 오르가노이드는 4 일째에 나타납니다. 사악한 것을 수확하고 그로 인한 오르가노이드를 재배할 때 토굴 오염을 피하기 위해 적절한 조치를 취하는 것이 중요합니다.
동일한 돌연변이의 토굴과 사악에서 나오는 오르가노이드 사이의 표현성 차이는 이 절차에 따라 관찰되었기 때문에 둘 사이의 분자 차이를 찾기 위해 추가 실험을 수행할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 내인성 토굴에서 발생하는 오르가노이드와 분화 제거로 인해 발생하는 ectopic 토굴사이의 차이점을 연구하는 데 사용될 수 있으므로 탈분화의 의미를 해결할 수 있습니다.
