Este método é adequado para imagens vivas da dinâmica citoplasmática utilizando extratos de ovos de rã, possibilitando o estudo de informações de padrões espaciais no citoplasma. As amostras podem ser moldadas em uma camada com uma espessura uniforme e ajustável e fotografadas em um campo 2D ou volume 3D. Este método é rentável e fácil de implementar.
Comece aplicando uma camada de fita adesiva FEP em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, prepare os deslizamentos de tampa revestidos com fita FEP da mesma maneira.
Em seguida, aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP da lâmina, deixando o revestimento protetor descascado. Transfira os ovos para um copo de vidro de 400 mililitros e remova o máximo de tampão de postura de ovos possível por decantação. Em seguida, incube os ovos em 100 mililitros de solução desanimadora recém-preparada e agite-os suavemente.
Após cerca de três minutos, despeje a solução e adicione 100 mililitros de solução fresca de desânimo. Continue a incubação até que os ovos estejam bem embalados, mas evite deixar os ovos na solução desanimadora por mais de um total de cinco minutos. Após a incubação, retire a solução desanimadora o máximo possível e lave os ovos em tampão MMR 0,25x.
Gire os ovos e, em seguida, despeje o tampão. Repita algumas vezes até que um total de um litro do tampão seja usado para as lavagens. Em seguida, lave os ovos algumas vezes com um total de 400 mililitros de tampão de lise do ovo, removendo ovos anormais entre as lavagens.
Em seguida, use uma pipeta de transferência com uma ponta de corte larga para transferir os ovos para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 17 mililitros contendo um mililitro de tampão de lise de ovos. Gire o tubo em uma centrífuga clínica a 400 g por 15 segundos para embalar os ovos. Em seguida, remova o máximo possível do tampão de lise do ovo usando uma pipeta Pasteur.
Determinar o volume aproximado dos ovos embalados. em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro cada de aprotinina, leupeptina e citocalasina B e 50 microgramas por mililitro de ciclohexamida diretamente em cima dos ovos embalados. Esmague os ovos centrifundindo o tubo por 15 minutos a 12.000 g e quatro graus Celsius em um rotor de balde oscilante.
Em seguida, coloque uma agulha de calibre 18 a uma seringa. Com o bisel da ponta da agulha voltado para cima puncione o tubo do lado na parte inferior da camada citoplasmática e recupere o extrato desenhando lentamente. Transfira o extrato citoplasmático recuperado para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha-o no gelo.
Quando estiver pronto para a imagem, complemente o extrato com os reagentes desejados e sondas de imagem de fluorescência. Remova o revestimento protetor superior do espaçador de imagem na lâmina preparada e deposite aproximadamente sete microlitros de extrato no centro do poço. Aplique imediatamente a tampa revestida com fita FEP com o lado FEP voltado para o extrato para selar o poço e proceder rapidamente à imagem.
Coloque a lâmina em um microscópio invertido ou vertical com um palco motorizado e uma câmera digital. Fotografe os extratos nas posições espaciais desejadas em intervalos de tempo em canais de campo brilhante e fluorescência. Um experimento de lapso de tempo usando extratos de ovos de xenopus laevis para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase é mostrado aqui.
Após cerca de 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, áreas esgotadas de componentes citoplasmáticos de dispersão de luz foram visíveis tanto no campo brilhante quanto nos canais mitocondriais. Por cerca de 60 minutos à temperatura ambiente, um padrão espacial que consiste em compartimentos semelhantes a células deve ser bem estabelecido com microtúbulos formando uma estrutura oca semelhante a uma coroa de flores e mitocôndrias claramente divididas em cada compartimento. Uma comparação do desempenho do extrato em câmaras de imagem com e sem fitas FEP em vidro é mostrada aqui.
Na câmara feita com vidro FEP colado o extrato auto-organizado em padrões normais de célula como eles. Na câmara onde as superfícies de vidro não estavam cobertas pela fita FEP, o extrato mostrou padrões anormais de campo brilhante e microtúbulos que se tornaram cada vez mais interrompidos ao longo do tempo. Não foram observadas diferenças significativas na importação nuclear da proteína GST-mCherry-NLS.
As coisas importantes a lembrar são passivar as superfícies de vidro com fita FEP e remover todos os ovos ruins durante a preparação do extrato. Com este sistema, podemos controlar facilmente a espessura da amostra de extrato, abrindo caminho para padrões citoplasmáticos de imagem em 3D, usando microscopia de folha de luz.
