Этот метод подходит для живой визуализации цитоплазматической динамики с использованием экстрактов яиц лягушки, что позволяет изучать пространственную информацию о паттерне в цитоплазме. Образцы могут быть сформированы в слой с равномерной и регулируемой толщиной и визуализированы в 2D-поле или 3D-объеме. Этот метод экономически эффективен и прост в реализации.
Начните с нанесения слоя клейкой ленты FEP на стеклянный слайд с помощью роликового аппликатора. Отрежьте лишнюю ленту по краям чистым лезвием бритвы. Далее таким же образом подготовьте ленту FEP с покрытием крышки.
Затем нанесите двустороннюю липкую прокладку для визуализации на сторону слайда, покрытую лентой FEP, оставив защитный вкладыш неочищенным. Переложите яйца в стеклянный стакан объемом 400 миллилитров и удалите как можно больше буфера для яйцекладки путем декантирования. Затем высиживают яйца в 100 миллилитрах свежеприготовленного раствора для дежелирования и аккуратно закручивают их.
Примерно через три минуты вылейте раствор и добавьте 100 миллилитров свежего раствора для обезжелезивания. Продолжайте инкубацию до тех пор, пока яйца не будут плотно упакованы, но не оставляйте яйца в растворе для обезжелезивания более пяти минут. После инкубации удалите раствор для обезжелезивания как можно больше и вымойте яйца в буфере 0,25x MMR.
Закрутите яйца, затем вылейте буфер. Повторите несколько раз, пока для стирки не будет использован в общей сложности один литр буфера. Затем вымойте яйца несколько раз с помощью в общей сложности 400 миллилитров буфера лизиса яиц, удаляя аномальные яйца между промывками.
Затем используйте передаточную пипетку с широким нарезанным наконечником, чтобы перенести яйца в 17-миллилитровую центрифужную трубку с круглым дном, содержащую один миллилитр буфера лизиса яиц. Раскрутите трубку в клинической центрифуге по 400 г в течение 15 секунд, чтобы упаковать яйца. Затем удалите как можно больше буфера лизиса яиц с помощью пипетки Пастера.
Определите примерный объем упакованных яиц. затем добавляют по пять микрограммов на миллилитр каждого апротинина, лейпептина и цитохалазина В и 50 мкг на миллилитр циклогексамида непосредственно поверх упакованных яиц. Раздавите яйца центрифуя трубку в течение 15 минут при 12 000 г и четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ведра.
Затем прикрепите иглу 18 калибра к шприцу. Кончиком иглы, обращенным вверх, проколоть трубку со стороны на дне цитоплазматического слоя и восстановить экстракт, медленно рисуя. Перенесите восстановленный цитоплазматический экстракт в новую микроцентрифужную трубку и держите его на льду.
Когда вы будете готовы к изображению, дополните экстракт желаемыми реагентами и флуоресцентными зондами. Снимите верхний защитный вкладыш с распорки на подготовленном слайде и нанесите примерно семь микролитров экстракта в центр колодца. Немедленно нанесите покрытие с покрытием ленты FEP стороной FEP лицом к экстракту, чтобы загерметизировать скважину и быстро приступить к визуализации.
Установите затвор на перевернутый или вертикальный микроскоп с моторизованной сценой и цифровой камерой. Изображайте экстракты в нужных пространственных положениях во временных интервалах как в ярком поле, так и в флуоресцентных каналах. Здесь показан покадровый эксперимент с использованием экстрактов яиц xenopus laevis для изучения самоорганизации цитоплазмы во время интерфазы.
Примерно через 20 минут инкубации при комнатной температуре области, истощенные светорассеивающими цитоплазматическими компонентами, были видны как в ярком поле, так и в каналах митохондрий. Примерно к 60 минутам при комнатной температуре должна быть хорошо установлена пространственная картина, состоящая из клеточных отсеков с микротрубочками, образующими полую венокообразную структуру, и митохондриями, четко разделенными на каждый отсек. Здесь показано сравнение производительности экстракта в камерах визуализации с лентами FEP на стекле и без них.
В камере, изготовленной из заклеенного стекла FEP, экстракт самоорганизуется в нормальные клеточные узоры. В камере, где стеклянные поверхности не были покрыты лентой FEP, экстракт показывал аномальное яркое поле и микротрубочки, которые со временем становились все более нарушенными. Существенных различий в ядерном импорте белка GST-mCherry-NLS не наблюдалось.
Важно помнить, что стеклянные поверхности пассивируются лентой FEP и удаляют все плохие яйца во время приготовления экстракта. С помощью этой системы мы можем легко контролировать толщину образца экстракта, прокладывая путь для визуализации цитоплазматических узоров в 3D, используя микроскопию светового листа.
