Este método es adecuado para imágenes en vivo de la dinámica citoplasmática utilizando extractos de huevos de rana, lo que permite el estudio de la información de patrones espaciales en el citoplasma. Las muestras pueden formarse en una capa con un grosor uniforme y ajustable y obtener imágenes a través de un campo 2D o volumen 3D. Este método es rentable y fácil de implementar.
Comience aplicando una capa de cinta adhesiva FEP a un portaobjetos de vidrio con un aplicador de rodillos. Corte el exceso de cinta sobre los bordes con una cuchilla de afeitar limpia. A continuación, prepare los cubrecubiertos recubiertos con cinta FEP de la misma manera.
Luego aplique un espaciador de imágenes adhesivas de doble cara al lado recubierto de cinta FEP de la diapositiva, dejando el revestimiento protector sin pelar. Transfiera los huevos a un vaso de precipitados de vidrio de 400 mililitros y elimine la mayor cantidad posible de tampón de puesta de huevos por decantación. Luego incubar los huevos en 100 mililitros de solución desjante recién preparada y agitarlos suavemente.
Después de unos tres minutos, vierta la solución y agregue 100 mililitros de solución desejosa fresca. Continúe la incubación hasta que los huevos estén bien empaquetados, pero evite dejar los huevos en la solución desarticulada durante más de un total de cinco minutos. Después de la incubación, retire la solución desarticulada tanto como sea posible y lave los huevos en tampón MMR 0.25x.
Agite los huevos, luego vierta el amortiguador. Repita varias veces hasta que se use un total de un litro del tampón para los lavados. A continuación, lave los huevos varias veces con un total de 400 mililitros de tampón de lisis de huevo, eliminando los huevos anormales entre los lavados.
Luego use una pipeta de transferencia con una punta de corte ancho para transferir los huevos a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 17 mililitros que contenga un mililitro de tampón de lisis de huevo. Gire el tubo en una centrífuga clínica a 400 g durante 15 segundos para empacar los huevos. A continuación, retire la mayor cantidad posible del tampón de lisis del huevo con una pipeta Pasteur.
Determine el volumen aproximado de los huevos empacados. luego agregue cinco microgramos por mililitro de aprotinina, leupeptina y citocalasina B y 50 microgramos por mililitro de ciclohexamida directamente sobre los huevos empacados. Triturar los huevos centrifando el tubo durante 15 minutos a 12, 000 g y cuatro grados centígrados en un rotor de cubo oscilante.
Luego, coloque una aguja de calibre 18 en una jeringa. Con el bisel de la punta de la aguja hacia arriba perforar el tubo desde el lado en la parte inferior de la capa citoplasmática y recuperar el extracto dibujando lentamente. Transfiera el extracto citoplasmático recuperado a un nuevo tubo de microcentrífuga y manténgalo en hielo.
Cuando esté listo para obtener imágenes, complemente el extracto con los reactivos deseados y las sondas de imágenes de fluorescencia. Retire el revestimiento protector superior del espaciador de imágenes en el portaobjetos preparado y deposite aproximadamente siete microlitros de extracto en el centro del pozo. Aplique inmediatamente el cubrecubierto con cinta FEP con el lado FEP orientado hacia el extracto para sellar el pocillo y proceder rápidamente a la obtención de imágenes.
Coloque la diapositiva en un microscopio invertido o vertical con una platina motorizada y una cámara digital. Obtener imágenes de los extractos en las posiciones espaciales deseadas en intervalos de tiempo tanto en canales de campo brillante como de fluorescencia. Aquí se muestra un experimento de lapso de tiempo utilizando extractos de huevos de xenopus laevis para estudiar la autoorganización del citoplasma durante la interfase.
Después de unos 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, las áreas agotadas de componentes citoplasmáticos de dispersión de luz fueron visibles tanto en los canales de campo brillante como en los de mitocondrias. A los 60 minutos a temperatura ambiente, un patrón espacial que consiste en compartimentos similares a células debe estar bien establecido con microtúbulos que forman una estructura hueca en forma de corona y mitocondrias claramente divididas en cada compartimento. Aquí se muestra una comparación del rendimiento del extracto en cámaras de imagen con y sin cintas FEP en vidrio.
En la cámara hecha con vidrio FEP pegado con cinta adhesiva, el extracto se autoorganizó en patrones normales similares a células. En la cámara donde las superficies de vidrio no estaban cubiertas por la cinta FEP, el extracto mostró patrones anormales de campo brillante y microtúbulos que se interrumpieron cada vez más con el tiempo. No se observaron diferencias significativas en la importación nuclear de la proteína GST-mCherry-NLS.
Las cosas importantes a recordar son pasivar las superficies de vidrio con cinta FEP y eliminar todos los huevos malos durante la preparación del extracto. Con este sistema, podemos controlar fácilmente el grosor de la muestra extraída, allanando el camino para obtener imágenes de patrones citoplasmáticos en 3D, utilizando microscopía de lámina de luz.
