Questo metodo è adatto per l'imaging dal vivo della dinamica citoplasmatica utilizzando estratti di uova di rana, consentendo lo studio delle informazioni sul modello spaziale nel citoplasma. I campioni possono essere modellati in uno strato con uno spessore uniforme e regolabile e ripresi su un campo 2D o un volume 3D. Questo metodo è economico e facile da implementare.
Inizia applicando uno strato di nastro adesivo FEP su un vetrino con un applicatore a rulli. Tagliare il nastro adesivo eccessivo sui bordi con una lama di rasoio pulita. Quindi, preparare allo stesso modo i vetrini di copertura rivestiti con nastro FEP.
Quindi applicare un distanziatore per immagini adesivo a doppia faccia sul lato rivestito di nastro FEP del vetrino lasciando il rivestimento protettivo non sbucciato. Trasferire le uova in un becher di vetro da 400 millilitri e rimuovere il più possibile il tampone di deposizione delle uova decantando. Quindi incubare le uova in 100 millilitri di soluzione di dejellying appena preparata e ruotarle delicatamente.
Dopo circa tre minuti, versare la soluzione e aggiungere 100 millilitri di soluzione fresca di dejelly. Continuare l'incubazione fino a quando le uova sono ben imballate, ma evitare di lasciare le uova nella soluzione di dejellying per più di un totale di cinque minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il più possibile la soluzione di dejellying e lavare le uova in tampone MMR 0,25x.
Ruotare le uova, quindi versare il tampone. Ripetere alcune volte fino a quando non viene utilizzato un totale di un litro di tampone per i lavaggi. Quindi, lavare le uova alcune volte con un totale di 400 millilitri di tampone di lisi delle uova, rimuovendo le uova anomale tra i lavaggi.
Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento con una punta larga per trasferire le uova in una provetta centrifuga a fondo rotondo da 17 millilitri contenente un millilitro di tampone per lisi delle uova. Girare il tubo in una centrifuga clinica a 400 g per 15 secondi per confezionare le uova. Quindi rimuovere il più possibile il tampone di lisi dell'uovo utilizzando una pipetta Pasteur.
Determinare il volume approssimativo delle uova confezionate. quindi aggiungere cinque microgrammi per millilitro ciascuno di aprotinina, leupeptin e citocalasina B e 50 microgrammi per millilitro di cicloesamide direttamente sopra le uova confezionate. Schiacciare le uova concentrando il tubo per 15 minuti a 12.000 g e quattro gradi Celsius in un rotore a secchio oscillante.
Quindi, collegare un ago da 18 gauge a una siringa. Con la punta dell'ago smussare verso l'alto forare il tubo dal lato nella parte inferiore dello strato citoplasmatico e recuperare l'estratto disegnando lentamente. Trasferire l'estratto citoplasmatico recuperato in una nuova provetta da microcentrifuga e tenerlo in ghiaccio.
Quando è pronto per l'immagine, integrare l'estratto con i reagenti desiderati e le sonde di imaging a fluorescenza. Rimuovere il rivestimento protettivo superiore dal distanziatore di imaging sul vetrino preparato e depositare circa sette microlitri di estratto al centro del pozzetto. Applicare immediatamente il vetrino di copertura rivestito con nastro FEP con il lato FEP rivolto verso l'estratto per sigillare il pozzetto e procedere rapidamente all'imaging.
Impostare il vetrino su un microscopio invertito o verticale con un palco motorizzato e una fotocamera digitale. Immagini degli estratti nelle posizioni spaziali desiderate in intervalli di tempo sia nei canali di campo chiaro che di fluorescenza. Un esperimento time-lapse che utilizza estratti di uova di xenopus laevis per studiare l'auto-organizzazione del citoplasma durante l'interfase è mostrato qui.
Dopo circa 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente erano visibili aree citoplasmatiche impoverite di componenti citoplasmatici che diffondono la luce sia in campo chiaro che nei canali dei mitocondri. Entro circa 60 minuti a temperatura ambiente, un modello spaziale costituito da compartimenti simili a cellule dovrebbe essere ben stabilito con microtubuli che formano una struttura cava simile a una corona e mitocondri chiaramente suddivisi in ciascun compartimento. Qui viene mostrato un confronto delle prestazioni degli estratti nelle camere di imaging con e senza nastri FEP su vetro.
Nella camera realizzata con vetro nastrato FEP l'estratto si auto-organizzato in normali modelli simili a cellule. Nella camera in cui le superfici di vetro non erano coperte dal nastro FEP, l'estratto mostrava un campo luminoso anomalo e modelli di microtubuli che diventavano sempre più interrotti nel tempo. Non sono state osservate differenze significative nell'importazione nucleare della proteina GST-mCherry-NLS.
Le cose importanti da ricordare sono di passivare le superfici di vetro con nastro FEP e di rimuovere tutte le uova cattive durante la preparazione dell'estratto. Con questo sistema, possiamo facilmente controllare lo spessore del campione estratto, aprendo la strada all'imaging di modelli citoplasmatici in 3D, utilizzando la microscopia a foglio di luce.
