非洲爪蟾 用于可视化动态细胞质组织的蛋提取物制备和实时成像方法

该方法适用于使用青蛙卵提取物对细胞质动力学进行实时成像，从而能够研究细胞质中的空间模式信息。样品可以塑造成厚度均匀且可调节的层，并在 2D 视场或 3D 体积上成像。这种方法具有成本效益且易于实施。

首先用滚筒涂抹器将一层FEP胶带涂在载玻片上。用干净的剃须刀片剪掉边缘上多余的胶带。接下来，以相同的方式准备 FEP 胶带涂层的盖玻片。

然后将双面粘性成像垫片涂在载玻片的FEP胶带涂层面上，保持保护衬里不剥落。将鸡蛋转移到 400 毫升玻璃烧杯中，并通过倾析尽可能多地去除产卵缓冲液。然后将鸡蛋在 100 毫升新鲜制备的脱冻溶液中孵化并轻轻旋转。

约三分钟后，倒出溶液，加入100毫升新鲜果冻溶液。继续孵育，直到鸡蛋紧密包装，但避免将鸡蛋留在脱冻溶液中超过五分钟。孵育后，尽可能去除脱胶溶液，并在0.25x MMR缓冲液中洗涤鸡蛋。

旋转鸡蛋，然后倒掉缓冲液。重复几次，直到总共使用一升缓冲液进行洗涤。接下来，用总共400毫升的鸡蛋裂解缓冲液清洗鸡蛋几次，在洗涤之间去除异常鸡蛋。

然后使用带有宽切尖端的转移移液器将鸡蛋转移到含有一毫升鸡蛋裂解缓冲液的 17 毫升圆底离心管中。在临床离心机中以400g旋转试管15秒以包装鸡蛋。然后使用巴斯德移液管尽可能多地去除鸡蛋裂解缓冲液。

确定包装鸡蛋的大致体积。然后直接在包装好的鸡蛋上添加每毫升 5 微克抑肽酶、亮肽酶和细胞松弛素 B 以及每毫升 50 微克环己酰胺。通过在摆动桶转子中以 12， 000 克和 4 摄氏度离心管 15 分钟来压碎鸡蛋。

接下来，将18号针头连接到注射器上。针尖斜面朝上，从细胞质层底部的一侧刺穿管子，并通过缓慢抽取提取物来回收提取物。将回收的细胞质提取物转移到新的微量离心管中，并将其保存在冰上。

准备好成像后，用所需的试剂和荧光成像探针补充提取物。从准备好的载玻片上的成像垫片上取下顶部保护衬里，并在孔的中心沉积约7微升提取物。立即使用FEP胶带涂层盖玻片，FEP面朝向提取物以密封孔并快速进行成像。

将载玻片放在带有电动载物台和数码相机的倒置或正置显微镜上。在明场和荧光通道中以时间间隔在所需的空间位置对提取物进行成像。这里显示了使用非洲爪蟾卵提取物研究间期细胞质自组织的延时实验。

在室温下孵育约20分钟后，在明场和线粒体通道中都可以看到光散射细胞质成分耗尽的区域。在室温下约60分钟，由细胞样隔室组成的空间模式应该很好地建立，微管形成空心花环状结构，线粒体明确划分到每个隔室中。此处显示了在玻璃上使用和不使用FEP胶带的成像室中提取物性能的比较。

在用FEP胶带玻璃制成的腔室中，提取物自组织成正常的细胞样图案。在玻璃表面未被FEP胶带覆盖的腔室中，提取物显示出异常的明场和微管图案，随着时间的推移变得越来越混乱。在GST-mCherry-NLS蛋白的核输入方面没有观察到显着差异。

要记住的重要事项是用FEP胶带钝化玻璃表面，并在提取物制备过程中去除所有坏蛋。有了这个系统，我们可以轻松控制提取物样品的厚度，为使用光片显微镜对细胞质图案进行3D成像铺平了道路。