Bu yöntem, kurbağa yumurtası ekstraktları kullanılarak sitoplazmik dinamiklerin canlı görüntülenmesi için uygundur ve sitoplazmadaki mekansal desen bilgisinin incelenmesini sağlar. Numuneler, düzgün ve ayarlanabilir kalınlığa sahip bir katman halinde şekillendirilebilir ve bir 2B alan veya 3B hacim boyunca görüntülenebilir. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve uygulanması kolaydır.
Bir rulo aplikatörlü bir cam slayda bir FEP yapışkan bant tabakası uygulayarak başlayın. Kenarlardaki aşırı bandı temiz bir tıraş bıçağı ile kesin. Ardından, FEP bant kaplı kapak fişlerini aynı şekilde hazırlayın.
Ardından, kızağın FEP bant kaplı tarafına çift taraflı yapışkan bir görüntüleme aralayıcısı uygulayın ve koruyucu astarı soyulmadan bırakın. Yumurtaları 400 mililitrelik bir cam behere aktarın ve dekantasyon yaparak mümkün olduğunca fazla yumurtlama tamponunu çıkarın. Daha sonra yumurtaları 100 mililitre taze hazırlanmış dejelleme çözeltisi içinde kuluçkaya yatırın ve yavaşça döndürün.
Yaklaşık üç dakika sonra, çözeltiyi dökün ve 100 mililitre taze jelleşme çözeltisi ekleyin. Yumurtalar sıkıca paketlenene kadar inkübasyona devam edin, ancak yumurtaları jöle çözeltisinde toplam beş dakikadan fazla bırakmaktan kaçının. Kuluçkadan sonra, jelleştirici çözeltiyi mümkün olduğunca çıkarın ve yumurtaları 0.25x MMR tamponunda yıkayın.
Yumurtaları döndürün, sonra tamponu dökün. Yıkamalar için toplam bir litre tampon kullanılıncaya kadar birkaç kez tekrarlayın. Daha sonra, yumurtaları birkaç kez toplam 400 mililitre yumurta lizis tamponu ile yıkayın, yıkamalar arasında anormal yumurtaları çıkarın.
Ardından, yumurtaları bir mililitre yumurta lizis tamponu içeren 17 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarmak için geniş kesim uçlu bir transfer pipeti kullanın. Yumurtaları paketlemek için tüpü 400 g'da klinik bir santrifüjde 15 saniye boyunca döndürün. Daha sonra bir Pasteur pipeti kullanarak yumurta lizis tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
Paketlenmiş yumurtaların yaklaşık hacmini belirleyin. daha sonra aprotinin, leupeptin ve cytochalasin B'nin her birine mililitre başına beş mikrogram ve doğrudan paketlenmiş yumurtaların üzerine mililitre sikloheksamidin başına 50 mikrogram ekleyin. Sallanan bir kova rotorunda tüpü 12.000 g ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca merkezleyerek yumurtaları ezin.
Ardından, bir şırıngaya 18 gauge iğne takın. İğne ucu eğimi yukarı bakacak şekilde tüpü sitoplazmik tabakanın altındaki taraftan delin ve yavaşça çizerek ekstraktı geri kazanın. Geri kazanılan sitoplazmik ekstraktı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun.
Görüntülemeye hazır olduğunda, ekstraktı istenen reaktifler ve floresan görüntüleme probları ile destekleyin. Üst koruyucu astarı hazırlanan slayt üzerindeki görüntüleme aralayıcısından çıkarın ve kuyunun ortasına yaklaşık yedi mikrolitre ekstrakt biriktirin. Kuyuyu kapatmak ve hızlı bir şekilde görüntülemeye devam etmek için FEP bant kaplı kapak kaymasını derhal FEP tarafı ekstrakta bakacak şekilde uygulayın.
Slaytı, motorlu bir sahne ve dijital kamera ile ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop üzerine ayarlayın. Ekstraktları hem parlak alan hem de floresan kanallarındaki zaman aralıklarında istenen uzamsal konumlarda görüntüleyin. İnterfaz sırasında sitoplazmanın kendi kendine organizasyonunu incelemek için xenopus laevis yumurta ekstraktlarını kullanan hızlandırılmış bir deney burada gösterilmiştir.
Oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakikalık inkübasyondan sonra, ışık saçılan sitoplazmik bileşenlerin tükendiği alanlar hem parlak alanda hem de mitokondri kanallarında görülebiliyordu. Oda sıcaklığında yaklaşık 60 dakika boyunca, hücre benzeri bölmelerden oluşan mekansal bir desen, içi boş çelenk benzeri bir yapı oluşturan mikrotübüller ve her bölmeye açıkça yerleştirilmiş mitokondri ile iyi bir şekilde kurulmalıdır. Cam üzerinde FEP bantları olan ve olmayan görüntüleme odalarındaki ekstrakt performansının karşılaştırılması burada gösterilmiştir.
FEP bantlı camdan yapılmış odada, ekstrakt normal hücre benzeri desenlere kendi kendini organize etti. Cam yüzeylerin FEP bandı ile kaplanmadığı odada, ekstrakt zamanla giderek daha fazla bozulan anormal parlak alan ve mikrotübül desenleri gösterdi. GST-mCherry-NLS proteininin nükleer ithalatında anlamlı bir fark gözlenmedi.
Hatırlanması gereken önemli şeyler, cam yüzeyleri FEP bant ile pasifleştirmek ve ekstrakt hazırlama sırasında tüm kötü yumurtaları çıkarmaktır. Bu sistemle, ekstrakt numunesinin kalınlığını kolayca kontrol edebilir, ışık tabakası mikroskobu kullanarak sitoplazmik kalıpları 3D olarak görüntülemenin yolunu açabiliriz.
