이 방법은 개구리 알 추출물을 사용한 세포질 역학의 라이브 이미징에 적합하여 세포질의 공간 패턴 정보를 연구할 수 있습니다. 샘플은 균일하고 조정 가능한 두께의 레이어로 성형하고 2D 필드 또는 3D 볼륨에서 이미징할 수 있습니다. 이 방법은 비용 효율적이고 구현하기 쉽습니다.
롤러 어플리케이터로 유리 슬라이드에 FEP 접착 테이프 층을 적용하여 시작하십시오. 깨끗한 면도날로 가장자리에 과도한 테이프를 잘라냅니다. 다음으로 같은 방법으로 FEP 테이프 코팅 커버 슬립을 준비하십시오.
그런 다음 양면 접착 이미징 스페이서를 슬라이드의 FEP 테이프 코팅면에 적용하여 보호 라이너가 벗겨지지 않은 상태로 둡니다. 계란을 400 밀리리터 유리 비커로 옮기고 디캔팅하여 가능한 한 많은 알을 낳는 완충액을 제거하십시오. 그런 다음 계란을 100 밀리리터의 갓 준비된 탈염 용액에 넣고 부드럽게 소용돌이 치십시오.
약 3 분 후, 용액을 부어 내고 100 밀리리터의 신선한 탈염 용액을 첨가하십시오. 알이 단단히 포장 될 때까지 배양을 계속하되 총 5 분 이상 탈염 용액에 알을 두지 마십시오. 배양 후, 가능한 한 탈염 용액을 제거하고 0.25x MMR 완충액에서 알을 씻는다.
계란을 소용돌이 치고 버퍼를 붓습니다. 세척에 총 1 리터의 완충액이 사용될 때까지 몇 번 반복하십시오. 다음으로, 총 400 밀리리터의 계란 용해 완충액으로 계란을 몇 번 씻어서 세척 사이에 비정상적인 계란을 제거합니다.
그런 다음 넓게 자른 팁이 있는 이송 피펫을 사용하여 계란 용해 완충액 17밀리리터가 포함된 17밀리리터의 둥근 바닥 원심분리기 튜브로 계란을 옮깁니다. 400g의 임상 원심 분리기에서 튜브를 15 초 동안 돌려 계란을 포장합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 계란 용해 완충액을 제거하십시오.
포장 된 계란의 대략적인 부피를 결정하십시오. 그런 다음 포장 된 계란 위에 아프로 티닌, 류 펩틴 및 사이토 칼라 신 B를 각각 밀리리터 당 5 마이크로 그램과 시클로 헥사 마이드 밀리리터 당 50 마이크로 그램을 추가합니다. 스윙 버킷 로터에서 12, 000g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 튜브를 원심화하여 계란을 분쇄하십시오.
그런 다음 18 게이지 바늘을 주사기에 부착하십시오. 바늘 끝 경사가 위를 향하도록 하여 세포질층의 바닥 측면에서 튜브를 뚫고 천천히 당겨 추출물을 회수합니다. 회수된 세포질 추출물을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
이미징할 준비가 되면 원하는 시약과 형광 이미징 프로브로 추출물을 보충합니다. 준비된 슬라이드의 이미징 스페이서에서 상단 보호 라이너를 제거하고 웰 중앙에 약 7 마이크로 리터의 추출물을 침착시킵니다. 즉시 FEP 테이프로 코팅된 커버 슬립을 FEP 면이 추출물을 향하도록 하여 웰을 밀봉하고 신속하게 이미징을 진행한다.
전동 스테이지와 디지털 카메라가 있는 도립 또는 직립 현미경에 슬라이드를 놓습니다. 명시야 채널과 형광 채널 모두에서 시간 간격으로 원하는 공간 위치에서 추출물을 이미지화합니다. 간기 동안 세포질의 자가 조직을 연구하기 위해 xenopus laevis 계란 추출물을 사용한 타임랩스 실험이 여기에 표시됩니다.
실온에서 약 20분 동안 배양한 후 광산란이 고갈된 영역에서는 세포질 성분이 명시야 및 미토콘드리아 채널 모두에서 가시화되었다. 실온에서 약 60 분까지, 속이 빈 화환과 같은 구조를 형성하는 미세 소관과 각 구획으로 명확하게 분할되는 미토콘드리아로 세포와 같은 구획으로 구성된 공간 패턴이 잘 확립되어야합니다. 유리에 FEP 테이프가 있는 경우와 없는 이미징 챔버의 추출물 성능 비교가 여기에 나와 있습니다.
FEP 테이프 유리로 만든 챔버에서 추출물은 정상적인 세포와 같은 패턴으로 자기 조직화되었습니다. 유리 표면이 FEP 테이프로 덮여 있지 않은 챔버에서 추출물은 비정상적인 명시야 및 미세 소관 패턴을 보여 시간이 지남에 따라 점점 더 파괴되었습니다. GST-mCherry-NLS 단백질의 핵 수입에서 유의 한 차이는 관찰되지 않았다.
기억해야 할 중요한 사항은 FEP 테이프로 유리 표면을 부동태화하고 추출물을 준비하는 동안 모든 나쁜 계란을 제거하는 것입니다. 이 시스템을 사용하면 추출물 샘플의 두께를 쉽게 제어할 수 있으므로 라이트 시트 현미경을 사용하여 세포질 패턴을 3D로 이미징할 수 있습니다.
