وتستخدم هذه الطريقة لدراسة مستقبلات المخروط التي تعتبر ضرورية لرؤية ضوء النهار. ميزة هذه الأساليب هي أنها تستخدم بيض الدجاج المخصب ، والتي يسهل الوصول إليها ، وواحدة من المصدر الوحيد للثقافات المخروطية الأولية. تم استخدام البروتوكول لتحديد عامل حيوية المخروط المشتقة من رود ، وهو علاج واعد في المستقبل لتنكس الشبكية الموروث.
وعلاوة على ذلك، تم استخدام البروتوكول لدراسة التمثيل الغذائي مستقبلات ضوئية المخروط. باتباع البروتوكول الموصوف بعناية ، يجب أن يكون الفرد الذي خبرته في ثقافة الخلية الأولية ، قادرا على الحصول على ثقافة المخصب المخروطي بعد بضع محاولات فقط. ابدأ بجمع البيض المخصب الأسبوعي من مفرخ صناعي.
الحفاظ على البويضات المخصبة في 17 درجة مئوية في المختبر. لكل ثقافة، احتضان سبع بويضات مخصبة لمدة 24 ساعة في 20 درجة مئوية، ثم 136 ساعة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة مع الارتداد المتقطع للميل. لاستعادة أجنة الدجاج، اغسل سطح البيض بالمطهر، وكسر قشر البيض عن طريق إحداث ثقب في الجزء العلوي من القشرة مع كماشة مستقيمة كبيرة، ثم قطع القشرة لإزالة القبعة من البيض.
استخراج بلطف كل جنين من قشر البيض مع ملقط منحني ونقله إلى طبق بيتري تحتوي على برنامج تلفزيوني عقيمة ساخنة سابقا إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة المغلف الذي يحيط بالأجنة بعناية. تحقق من مرحلة تطور كل جنين من خلال المقارنة البصرية مع هامبورغر وهاملتون واختر جنينين في المرحلة التاسعة والعشرين من التطور ينمعين هذه الأجنة المختارة ونقلها إلى وسيط مستقل عن ثاني أكسيد الكربون.
العمل في المتوسط المستقل عن ثاني أكسيد الكربون، وضع أربع عيون مع القرنية التي تواجه أسفل والعصب البصري التي تواجه المجرب. حفر ثقب في العصب البصري باستخدام اثنين من ملقط مستقيم. أدخل فرعا من كل ملقط بين شبكية العين وظهارة الصباغ، ثم اسحب العين وتناوبها لفصل الظهارة عن شبكية العين.
إزالة القرنية، تليها العدسة وحيوية. نقل شبكية العين الأربعة إلى طبق بيتري يحتوي على متوسط رينغر في درجة الحموضة 7.2. قطع شبكية العين الأربعة إلى قطع صغيرة جدا باستخدام كماشة اثنين على التوالي وغسل القطع مرتين مع المتوسط رينغر.
بعد الغسيل الثاني، اترك قطع شبكية العين تسقط إلى أسفل الأنبوب وأزل الوسائط. علاج قطع الشبكية مع محلول من تريبسين لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد 20 دقيقة، وقف رد الفعل عن طريق إضافة وسائل الإعلام الثقافة تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنين المعطل.
احتضان تعليق الخلية مع 0.05 ملغ من DNase 1 ثم ينفصم على الفور مجموعات الخلية والحمض النووي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة. اغسل تعليق خلايا الشبكية مرتين باستخدام وسيط ثقافي محدد كيميائيا أو آلية التنمية النظيفة. علاج اثنين من لوحات ثقافة 96 جيدا السوداء مع قاع شفاف مع البوليليسين لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
عند الانتهاء، شطف لوحات مرتين مع M199 ثقافة المتوسطة. إضافة تريبان الأزرق إلى aliquot من 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لتلطيخ الخلايا الحية. ثم أضف عينة تعليق الخلية إلى مقياس الدم.
بعد عد الخلايا، جلب تعليق الخلية إلى التركيزات المناسبة باستخدام آلية التنمية النظيفة. إضافة 50 ميكرولتر من مكتبة الجزيئات ليتم فحصها باستخدام نمط محدد مسبقا. البذور 50 ميكرولتر من تعليق الخلية اثنين في اثنين من لوحات ثقافة 96 جيدا السوداء المعالجة مسبقا.
توزيع الخلايا في لوحات مع ماصة متعددة القنوات من يمين لوحة إلى اليسار، والتجانس بين كل عمود. ثم احتضان لوحات لمدة سبعة أيام في 37 درجة مئوية، تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع أي تغيير في وسائل الإعلام. لحساب الخلايا القابلة للحياة، أضف 2.7 كالسيين ميكرومولار AM و 0.3 ملليمولار إيثيديوم هوميديمر إلى كل بئر من اللوحة.
احتضان لوحات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غياب الضوء. اقرأ الفلورسينس على قارئ لوحة آلي يتكون من مجهر مقلوب مجهز بمصباح زئبق مع فلترين للإثارة بدقة 485 و520 نانومتر، ومرشحين للانبعاثات بدقة 520 و635 نانومتر وكاميرا جهاز مقرونة بالشحن. تم استخدام هذا البروتوكول لفحص مكتبة cDNA طبيعية مصنوعة من ظهارة مصطبغة المشيمية والشبكية من 400 عين من الفئران لونغ إيفانز البالغ من العمر ثمانية أسابيع.
وتم تقييم اجمالى 2112 مجموعة من 100 مستنسخ مقابل 211200 استنساخ فردى . ومن بين 42 بركة من المستنسخين بنسبة أكبر من اثنين، كان للمجمعات 0080 و0073 نسبة صلاحية أعلى ب 16 و14 مرة من السيطرة السلبية بعد سبعة أيام من الثقافة. تم تقسيم كل مجموعة مختارة من 100 استنساخ إلى 16 مجموعة من 10 استنساخات من مخزونها من الجلسرين.
أعطى المجمع الفرعي 0073-09 أقوى نسبة صلاحية وتم تقسيمه لإنتاج 16 استنساخا فرديا تم اختباره في جولة ثالثة من الفحص على الثقافات المخصبة بالمخروط. واستنساخ 0073-09-37 وقفت مع نسبة البقاء من 2.5. وأكد مزيد من التحليل أن هذا استنساخ له تأثير قوي وقابل للاستنساخ على البقاء على قيد الحياة مخروط.
وتكرر الاختبار بشكل مستقل وتم تسلسل إدخال 1.8 كيلوباس. وكشف تحليل معلوماتي حيوي أن المستنسخ 0073-09-37، الذي كان اسمه عامل حيوية المخروط المشتقة من الظهارة، أو EdCVF يحتوي على ثلاثة إطارات قراءة مفتوحة. عند اختبارها بشكل مستقل ، فقط ORF1 مارست تأثير وقائي على المخاريط.
تم إنتاج ORF1 كبروتين الجلوتاثيون S-transferase. تم تنقية عامل صلاحية المخروط المشتق من الظهارة وإزالة علامة GST. أظهر تحليل النشاط الغذائي أن EdCVF قادر على منع انحطاط المخروط في نظام الثقافة المخصب بالمخروط.
عند محاولة هذا الإجراء ، يجب فحص مرحلة تطور الأجنة بعناية من أجل الحصول على الثقافات المخصبة بالمخروط. بعد هذا البروتوكول، يمكن أن تكون الخلايا كهربائيا مع الحمض النووي البلازميد لدراسة الآليات الجزيئية لأي عوامل البقاء على قيد الحياة مثل RdCVF. هذه التقنية تمهد البحوث الأيضية بما في ذلك تطوير نماذج رياضية من البقاء على قيد الحياة مخروط.
