نقترح طريقة لتنظيم نشاط البوليميراز باستخدام عوامل نسخ الحمض النووي الاصطناعي. يمكن أن تكون هذه البنية التنظيمية الجينية بمثابة لبنة لبناء الأجهزة الوراثية المختبرية في المستقبل. من خلال ربط مجال ربط الحمض النووي إلى بوليمرات T7 RNA ، تجمع هذه التقنية بين قابلية التوسع في الدوائر المستندة إلى الحمض النووي ، مع وظيفة الدوائر النسخية.
ابدأ بإجراء تسعة تمييعات من أوليغونوكليوتيد BG أحادية التقطعت إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج ، من خمس إلى واحد إلى واحد إلى خمس نسب ، كما هو مبين في الجدول. إعداد خليط رد فعل واحد لكل تخفيف عن طريق خلط اثنين من microliters من العازلة SNAP مع أربعة ميكرولترات من أوليغونوكليوتيد BG، وأربعة ميكرولترات من SNAP T7 RNAP. إعداد التحكم RNAP عن طريق استبدال oligonucleotide مع الماء المقطر مزدوجة، والسيطرة على الحمض النووي عن طريق استبدال سناب T7 RNAP مع الماء المقطر مزدوجة.
إعداد 11 ردود الفعل عن طريق إضافة اثنين من microliters من كل عينة إلى أربعة ميكرولترات من العازلة SNAP، واثنين من microliters من البروتين تحميل صبغة لكل عينة. سخني التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية، قبل تحميل اثنين من الميكرويترات من كل عينة على هلام بروتين حيوي من 4 إلى 12٪ لمدة 35 دقيقة من الكهرومورفوريس الهلامي على الجليد عند 200 فولت. في نهاية الشوط، اغسل الجل بثلاثة مبادلات مياه على شاكر لمدة 10 دقائق على الأقل لكل غسل، يليه تلطيخ الحمض النووي بصبغة سيانين لمدة 15 دقيقة.
صورة هلام على نظام التصوير هلام المناسبة، ووصمة عار هلام مرة أخرى مع 20 ملليلتر من الأزرق Coomassie. بعد ساعة واحدة، وإزالة وصمة عار مع الماء المقطر مزدوجة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تصوير هلام مرة أخرى. لتنقية SNAP T7 المربوطة ب oligonucleotide ، أولا ، قم بإعداد حاجز elution عن طريق خلط 50 ميكرولتر من أثر مولار واحد ، مع 100 ميكرولتر من خمسة كلوريد صوديوم مولار ، مع 850 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.
بعد ذلك، ضع عمود تبادل أيون واحد لكل عينة في أنبوبي طرد مركزي من ملليلتر، واغسل الأعمدة بحاجز تنقية عن طريق الطرد المركزي حتى يتم إزالة كل العازل من كل عمود. تمييع كل عينة مع عازلة تنقية في مخزن مؤقت للتنقية ثلاثة إلى واحد إلى نسبة العينة، وتحميل 400 ميكرولتر من العينة في كل عمود. عند كافة المخزن المؤقت تم eluted كما هو موضح، تجميع وتسمية التدفق من خلال كل عينة.
غسل الأعمدة ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من العازلة تنقية لكل غسل حتى تم eluted كل العازلة لكل غسل، وجمع ووضع العلامات على تدفق من خلال حسب الاقتضاء. بعد الغسيل الأخير ، اجمع البروتين الملوت بإضافة 50 ميكرولتر من العازلة elution إلى وسط العمود ، والطرد المركزي للعمود ثلاث مرات حتى يتم إلغاء جميع ال 50 ميكرولتر من العازلة. جمع وتسمية elute بعد كل الطرد المركزي، وتجميع elute في أنبوب واحد بعد الطرد المركزي الماضي، في حين ترك حجم صغير من كل elute لتحليل هلام.
قياس امتصاص aliquots elute المتبقية في 260 و 280 نانومتر، وإضافة الجلسرين إلى العينات بنسبة واحد إلى واحد لتخزين ناقص 20 درجة حتى استخدامها. استخدم وحدة تصفية مركزية سعة 500 ميكرولتر 30 كيلودالتون لتبادل إجمالي المنتج elute مع مخزن تخزين مؤقت 2x. وقياس الامتصاص كما هو موضح.
ثم إضافة الجلسرين إلى المنتج بنسبة واحد إلى واحد للتخزين ناقص 20 درجة مئوية. لتقييم elutes بواسطة SDS-PAGE، قم بتشغيل العينات في سلم بروتين مناسب على هلام حيوي من 4 إلى 12٪ لمدة 35 دقيقة عند 200 فولت، أو حتى تهاجر جبهة الصبغة إلى نهاية الجل. لإظهار نشاط التحكم عند الطلب في RNAP المربوطة، امزج 2.4 ميكرولتر من كل قالب مع خمسة ميكرولترات من العازلة 5x، و 14.2 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.
احتضان الناتجة عن واحد micromolar مزدوجة تقطعت بهم السبل قفص الحمض النووي في 75 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وآني الشعور وسلالات مضادة للإحساس من المروج وmalachite الأخضر aptamer قالب الحمض النووي بنفس الطريقة كما هو مبين في الجدول. في نهاية الحضانات، أضف SNAP T7 RNAP المربوط إلى قفص الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بنسبة 1 إلى 5 أضراس إلى تركيز نهائي قدره 500 نانومولار RNAP.
بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ضع العينة على الجليد، واخلط 2.5 ميكرولتر من 10x في المخزن المؤقت للنسخ المختبري مع ميكرولتر واحد من 25 ملليمولار ريبونوكليوسيد ثلاثي الفوسفات، وميكرونيتر واحد من مالاتشيت ملليمولار واحد أخضر، و 2.5 ميكرولتر من خليط RNAP CAGE، و 2.5 ميكرولتر لكل من عوامل النسخ الميكروبية واحد A و B oligonucleotides وثلاثة ميكرولترات من قالب واحد ملاخي ملاخي أخضر في 10 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. في 15 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج ، قم بإعداد رد فعل ثان يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 10x في مخزن النسخ المختبري ، وميكرولتر واحد من 25 مزيج ثلاثي الفوسفات ثلاثي الريبونوكليوسيد من المليمولار ، و2.5 ميكرولتر من خليط RNAP CAGENAP ، وثلاثة ميكرولترات من قالب ملاطخي أخضر واحد من ملاط لإعداد رد فعل يحتوي على العازلة فقط، مزيج 2.5 ميكرولتر من 10x في المخزن المؤقت النسخ المختبري، ميكرولتر واحد من 25 ملليمولار ريبونوكليوسيد مزيج ثلاثي الفوسفات، ميكرولتر واحد من واحد ملاكيت مليومولار الأخضر، وثلاثة ميكرولتر من قالب واحد ملاخية ملاخية الأخضر aptamer في 17.5 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج.
عندما يتم إعداد جميع ردود الفعل ، قم بنقل كل رد فعل إلى لوحة 384 بئرا ، وراقب نسخ aptamer الأخضر malachite على قارئ لوحة مضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية عند إثارة 610 نانومتر ، وانبعاث 655 نانومتر. في نهاية القراءة، ضع اللوحة على الجليد، وتشغيل المنتج الجيش الملكي النيبالي من كل بئر في إزالة الطبيعة 12٪ TBE-اليوريا هلام البولي أكريليك في 70 درجة مئوية TBE العازلة في 280 فولت لمدة 20 دقيقة، أو حتى الجبهة صبغ يصل إلى نهاية الجل. ثم، وصمة عار هلام مع صبغة السيانين وصمة عار حمض النيوكليك لمدة 10 دقائق على شاكر المدارية، قبل التصوير كما هو موضح.
يمكن تأكيد نجاح التعبير وتنقية بروتين SNAP T7 RNAP المؤتلف باستخدام SDS-PAGE. بعد SDS-PAGE، يمكن التحقق من صحة النشاط الأنزيمي من خلال رد فعل النسخ في المختبر. يمكن التحقق من اقتران ناجح من Oligonucleotides BG وظيفية عن طريق 18٪ denaturing TBE-urea PAGE.
بالمقارنة مع أوليغونوكليوتيد غير المعدلة، إضافة moiety BG إلى أوليغونوكليوتيد يزيد من وزنه الجزيئي. كما لوحظ في هذا الممثل صبغة السيانين وصمة عار هلام لتأكيد الحمض النووي المربوطة T7 RNAP تنقية من oligonucleotides BG الزائدة، وتدفق الأولي من خلال جزء يحتوي على معظمها فائض BG oligonucleotide، فضلا عن جزء صغير من البوليميراز الحمض النووي المربوطة التي لم ترتبط راتنج تبادل cation. تحتوي كسور تخفيف المسبح فقط على النطاق الوحيد من أوليغو RNAP الناجم عن ربط صبغة السيانين بحبل oligonucleotide ، مع عرض حارة المنتج المركزة نفسها ، ولكن الفرقة الداكنة مما يدل على تركيز ناجح.
ويلاحظ نفس الأنماط من قبل تلطيخ الأزرق Coomassie، مع تحول حركة هلام صغير لوحظ في السيطرة RNAP غير المقترنة. هنا، تظهر إشارة الفلورسنت المنتجة في نهاية النسخ في المختبر في الحركية في الوقت الحقيقي. في هذا التحليل، لوحظ تنشيط 336 أضعاف في إشارة الفلورية، مما يدل على وجود سيطرة قوية على نشاط البوليميراز.
عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تغسل بدقة SDS قبالة هلام قبل تلطيخ الحمض النووي. وذلك لأن STS سوف فخ الصبغة في هلام، مما أدى إلى إشارة خلفية عالية. تطبيق طريقتنا على دائرة جينية كبيرة مع سلاسل متعددة سوف تظهر قابلية وتكليف نظام النسخ المربوطة.
وتستخدم هذه التقنية حاليا لتطوير دوائر جينية قادرة على حساب نمط الشبكة العصبية.
