人工核酸転写因子を用いてポリメラーゼ活性を調節する方法を提案する.この遺伝子調節アーキテクチャは、将来のインビトロ遺伝子デバイスのビルディングブロックとして機能します。この技術は、DNA結合ドメインをT7 RNAポリメラーゼにテザリングすることにより、DNAベースの回路の拡張性と転写回路の機能性を兼ね備えています。
表に示すように、1本鎖BGオリゴヌクレオチドを50マイクロリットルの二重蒸留水の最終体積に9回希釈させることから始めます。4マイクロリットルのBGオリゴヌクレオチドと4マイクロリットルのSNAP T7 RNAPを4マイクロリットル混合して、各希釈ごとに1つの反応混合物を調製します。オリゴヌクレオチドを二重蒸留水に置き換え、SNAP T7 RNAPを二重蒸留水に置き換えてDNA制御を行い、RNAP制御を準備します。
各サンプルの2マイクロリットルを4マイクロリットルのSNAPバッファーに加え、サンプルあたり2マイクロリットルのタンパク質負荷染料を加えることで、11個の反応を設定します。各サンプルの2マイクロリットルを4~12%のバイトラルプロテインゲルに200ボルトで氷上で35分間加熱し、10分間加熱します。実行の最後に、シェーカー上の3つの水交換でゲルを洗浄し、1回の洗浄で少なくとも10分間洗浄し、続いてシアニン色素で核酸染色を15分間洗浄します。
適切なゲルイメージングシステム上のゲルを画像化し、20ミリリットルのクマシーブルーで再びゲルを染色します。1時間後、再びゲルをイメージングする前に少なくとも1時間、二重蒸留水で脱染色する。オリゴヌクレオチドとつながれたSNAP T7精製の場合、まず、50マイクロリットルの1モルトレースを50マイクロリットル混合し、5モル塩化ナトリウムを100マイクロリットル、850マイクロリットルの二重蒸留水で混合して溶出バッファーを調製する。
次に、サンプルごとに1つのイオン交換カラムを個々の2つのミリリットル遠心管に入れ、各カラムからすべてのバッファーが溶出するまで遠心分離によって精製バッファーでカラムを洗浄します。各サンプルを精製バッファーで 3 ~ 1 の精製バッファーで希釈し、サンプル比に対して 400 マイクロリットルのサンプルを各カラムに積み込みます。すべてのバッファーが示されているように溶出したら、各サンプルのフローを収集し、ラベルを付けます。
洗浄ごとにすべてのバッファーが溶出し、必要に応じてフロースルーを収集してラベリングするまで、洗浄ごとに400マイクロリットルの精製バッファーでカラムを3回洗浄します。最後の洗浄後、50マイクロリットルの溶出バッファーをカラムの中央に加え、50マイクロリットルのバッファーがすべて溶出するまでカラムを3回遠心分離して溶出したタンパク質を回収します。各遠心分離後にエルテを収集し、ゲル分析のために各エルトの少量を残しながら、最後の遠心分離後に単一のチューブにエルトをプールします。
260および280ナノメートルで残りのエルテアリコートの吸光度を測定し、使用するまでマイナス20度の貯蔵のための1対1の比率でサンプルにグリセロールを加えます。500マイクロリットル30キロダルトンの中心フィルターユニットを使用して、2倍の貯蔵バッファとの総エルト製品をバッファ交換します。そして、実証したように吸光度を測定する。
その後、マイナス20°Cの貯蔵のための1対1の比率で製品にグリセロールを追加します。SDS-PAGEでエルトを評価するには、200ボルトで35分間、または色素フロントがゲルの端まで移動するまで、適切なタンパク質ラダーでサンプルを4〜12%のバイトラで実行します。テザーRNAPのオンデマンド制御活動を実証するには、各テンプレートの2.4マイクロリットルを5マイクロリットルの5マイクロアニーリングバッファと、14.2マイクロリットルの二重蒸留水と混合します。
得られた1つのマイクロモル二本鎖DNA CAGEを摂氏75度で2分間インキュベートする。そして、表に示されるのと同様に、プロモーター及びマラカイトグリーンアプタマーDNA鋳型のセンス及び抗センス株をアニールする。インキュベーションの最後に、500ナノモルRNAPの最終濃度に対して1〜5モル比で二本鎖DNA CAGEにつながれたSNAP T7 RNAPを追加します。
室温で15分後、氷の上にサンプルを置き、25ミリモルリボヌクレシド三リン酸の1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンの1マイクロリットル、RNAP CAGEの2.5マイクロリットル、混合物2.5マイクロモララー転写因子とB鎖状配列とB.鎖状の10xの転写バッファーの2.5マイクロリットルを混合します。 10マイクロリットルの二重蒸留水に1ミリモルマラカイトグリーンアプタマーテンプレートの3マイクロリットル。15マイクロリットルの二重蒸留水に、2.5マイクロリットルの10xインビトロ転写バッファー、25ミリモルリボヌクレオシド三リン酸ミックスの1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンの1マイクロリットル、RNAP混合物CAGEの2.5マイクロリットル、および1ミリモラルマラーテアパターガーアパタータタラの3マイクロリットルを含む第2の反応を設定する。バッファーのみを含む反応を設定するには、2.5マイクロリットルの10xインビトロ転写バッファー、25ミリモルリボヌクレオシドトリリン酸ミックスの1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンの1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンアプタマーテンプレートの3マイクロリットルを17.5マイクロリットルの二重蒸留水に混ぜます。
すべての反応が調製されたら、各反応を384ウェルプレートに移し、610ナノメートルの励起で摂氏37度で2時間、蛍光プレートリーダー上のマラカイトグリーンアプタマー転写を監視し、655ナノメートルの発光を行います。読み取りの最後に、プレートを氷の上に置き、20分間、または染料前部がゲルの端に達するまで、摂氏70度TBEバッファーで変性12%TBE-尿素ポリアクリルゲル内の各ウェルからRNA製品を実行します。次いで、シアニン色素核酸染色を軌道シェーカー上で10分間、実証したようにイメージングする前にゲルを染色する。
組換えSNAP T7 RNAPタンパク質の発現と精製が成功したのは、SDS-PAGEを用いて確認できる。SDS-PAGEに続いて、酵素活性は、インビトロ転写反応によって検証することができる。BG機能性オリゴヌクレオチドの結合に成功すると、18%変性TBE-尿素PAGEを介して検証することができます。
非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、その分子量が増加するのが、オリゴヌクレオチドにBG部分を添加する。この代表的なシアニン色素染色体ゲルで観察されるように、過剰なBGオリゴヌクレオチドからのDNAにつながれたT7 RNAP精製を確認するために、分画を通る最初の流れは、ほとんどが過剰なBGオリゴヌクレオチドを含み、ならびに、カチオン交換樹脂に結合しなかったDNA結合ポリメラーゼのごく一部を含んでいた。プール希釈画分には、オリゴヌクレオチドテザーに結合するシアニン色素によって引き起こされるRNAPオリゴの単一バンドのみが含まれ、アップ濃縮された製品レーンは同じを示すが、より暗いバンドは正常なアップ濃度を示した。
同じパターンは、クーマッシーブルー染色によって観察され、非共役RNAP制御で観察された小さなゲル移動性シフトを有する。ここで、リアルタイム運動におけるインビトロ転写の終了時に生成される蛍光シグナルが示されている。この分析では、蛍光シグナルにおける336倍の活性化が観察され、ポリメラーゼ活性の強い制御を実証した。
このプロトコルを試す際には、核酸染色の前に、ゲルからSDSを十分に洗い流してください。これは、STSが色素をゲルにトラップし、高いバックグラウンド信号を生じるためです。複数のカスケードを持つ大きな遺伝子回路に我々の方法を適用することは、テザリング転写システムのスケーラビリティと合成可能性を示す。
この技術は、現在、ニューラルネットワークスタイルの計算が可能な遺伝子回路の開発に使用されています。
