Proponiamo un metodo per regolare l'attività della polimerasi utilizzando fattori di trascrizione dell'acido nucleico artificiale. Questa architettura di regolazione genica può servire come elemento costitutivo per i futuri dispositivi genetici in vitro. Legando un dominio di legame del DNA a una T7 RNA polimerasi, questa tecnica combina la scalabilità dei circuiti basati sul DNA con la funzionalità dei circuiti trascrizionali.
Inizia facendo nove diluizioni di oligonucleotide BG a singolo filamento per un volume finale di 50 microlitri di acqua doppia distillata, da cinque a uno a uno a cinque rapporti, come indicato nella tabella. Preparare una miscela di reazione per ogni diluizione mescolando due microlitri di tampone SNAP con quattro microlitri di oligonucleotide BG e quattro microlitri di SNAP T7 RNAP. Preparare il controllo RNAP sostituendo l'oligonucleotide con acqua doppia distillata e il controllo del DNA sostituendo lo SNAP T7 RNAP con acqua doppia distillata.
Impostare 11 reazioni aggiungendo due microlitri di ciascun campione a quattro microlitri di tampone SNAP e due microlitri di colorante a carico proteico per campione. Riscaldare le reazioni per 10 minuti a 70 gradi Celsius, prima di caricare due microlitri di ciascun campione su un gel proteico vitreo dal quattro al 12% per 35 minuti di elettroforesi su gel su ghiaccio a 200 volt. Alla fine della corsa, lavare il gel con tre scambi d'acqua su uno shaker per almeno 10 minuti per lavaggio, seguito da colorazione dell'acido nucleico con colorante al cianine per 15 minuti.
Immagina il gel su un sistema di imaging del gel appropriato e colora di nuovo il gel con 20 millilitri di blu Coomassie. Dopo un'ora, demacchiare con acqua doppia distillata per almeno un'ora prima di visualizzare nuovamente il gel. Per la purificazione SNAP T7 legata agli oligonucleotidi, in primo luogo, preparare il tampone di eluizione mescolando 50 microlitri di una traccia molare, con 100 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari, con 850 microlitri di acqua doppia distillata.
Quindi, posizionare una colonna di scambio ionico per campione in singoli tubi di centrifuga da due millilitri e lavare le colonne con tampone di purificazione mediante centrifugazione fino a quando tutto il tampone non è stato eluito da ciascuna colonna. Diluire ogni campione con tampone di purificazione a un rapporto tre a uno tampone di purificazione / campione e caricare 400 microlitri di campione in ogni colonna. Quando tutto il tampone è stato eluito come dimostrato, raccogliere ed etichettare il flusso per ciascun campione.
Lavare le colonne tre volte con 400 microlitri di tampone di purificazione per lavaggio fino a quando tutto il tampone è stato eluito per lavaggio, raccogliendo ed etichettando il flusso attraverso come appropriato. Dopo l'ultimo lavaggio, raccogliere la proteina eluita aggiungendo 50 microlitri di tampone di eluizione al centro della colonna e centrifugando la colonna tre volte fino a quando tutti i 50 microlitri di tampone sono stati eluiti. Raccogliere ed etichettare l'eluto dopo ogni centrifugazione, raggruppando l'eluitore in un singolo tubo dopo l'ultima centrifugazione, lasciando un piccolo volume di ciascun eluito per l'analisi del gel.
Misurare l'assorbanza delle aliquote elute rimanenti a 260 e 280 nanometri e aggiungere glicerolo ai campioni in un rapporto uno a uno per meno 20 gradi di conservazione fino al loro utilizzo. Utilizzare un'unità filtrante centrifica da 500 microlitri da 30 kilodalton per sostituire il buffer del prodotto elute totale con un buffer di stoccaggio 2x. E misurare l'assorbanza come dimostrato.
Quindi aggiungere glicerolo al prodotto in un rapporto uno a uno per meno 20 gradi Celsius di conservazione. Per valutare gli eluiti da SDS-PAGE, eseguire i campioni in un'appropriata scala proteica su un gel vitreo dal quattro al 12% per 35 minuti a 200 volt, o fino a quando il fronte colorante migra verso l'estremità del gel. Per dimostrare l'attività di controllo su richiesta dell'RNAP legato, mescolare 2,4 microlitri di ciascun modello con cinque microlitri di tampone di ricottura 5x e 14,2 microlitri di acqua distillata doppia.
Incubare il risultante un micromolare DNA CAGE a doppio filamento a 75 gradi Celsius per due minuti. E ricottura i ceppi sensoriali e anti-senso del promotore e del modello di DNA dell'aptamero verde malachite nello stesso modo indicato nella tabella. Alla fine delle incubazioni, aggiungere lo SNAP T7 RNAP legato alla CAGE a doppio filamento di DNA con un rapporto da uno a cinque molari a una concentrazione finale di 500 RNAP nanomolari.
Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, posizionare il campione su ghiaccio e mescolare 2,5 microlitri di tampone di trascrizione in vitro 10x con un microlitro di 25 millimolari ribonucleoside trifosfato, un microlitro di un verde malachite millimolare, 2,5 microlitri della miscela RNAP CAGE, 2,5 microlitri ciascuno di un filamento di oligonucleotidi dei fattori di trascrizione micromolare A e B, e tre microlitri di un modello di aptamer verde malachite millimolare in 10 microlitri di acqua doppia distillata. In 15 microlitri di acqua doppia distillata, impostare una seconda reazione contenente 2,5 microlitri di 10x tampone di trascrizione in vitro, un microlitro di 25 millimolari ribonucleoside trifosfato miscela, un microlitro di un verde malachite millimolare, 2,5 microlitri della miscela RNAP CAGE e tre microlitri di un modello di aptamero verde malachite millimolare. Per impostare una reazione contenente solo tampone, mescolare 2,5 microlitri di 10x tampone di trascrizione in vitro, un microlitro di 25 millimolari ribonucleoside trifosfato mix, un microlitro di un millimolare di verde malachite e tre microlitri di un modello di aptamero verde malachite millimolare in 17,5 microlitri di acqua doppia distillata.
Quando tutte le reazioni sono state preparate, trasferire ogni reazione su una piastra a 384 pozzetti e monitorare la trascrizione dell'aptamero verde malachite su un lettore di piastre a fluorescenza per due ore a 37 gradi Celsius a un'eccitazione di 610 nanometri e un'emissione di 655 nanometri. Alla fine della lettura, posizionare la piastra su ghiaccio ed eseguire il prodotto RNA da ciascun pozzetto in un gel poliacrilico denaturizzante al 12% TBE-urea in tampone TBE a 70 gradi Celsius a 280 volt per 20 minuti, o fino a quando il fronte colorante raggiunge la fine del gel. Quindi, colorare il gel con la colorazione di acido nucleico colorante cianina per 10 minuti su uno shaker orbitale, prima di eseguire l'imaging come dimostrato.
Un'espressione e una purificazione di successo della proteina RNAP SNAP T7 ricombinante possono essere confermate utilizzando SDS-PAGE. Seguendo SDS-PAGE, l'attività enzimatica può essere convalidata mediante reazione di trascrizione in vitro. L'accoppiamento riuscito di oligonucleotidi funzionalizzati BG può essere verificato tramite IL 18% di TBE-urea PAGE denaturante.
Rispetto all'oligonucleotide non modificato, l'aggiunta della porzione BG all'oligonucleotide aumenta il suo peso molecolare. Come osservato in questo gel di colorazione del colorante cianine rappresentativo per confermare la purificazione T7 RNAP legata al DNA dagli oligonucleotidi BG in eccesso, il flusso iniziale attraverso la frazione conteneva principalmente oligonucleotide BG in eccesso, così come una piccola porzione della polimerasi legata al DNA che non si legava alla resina a scambio cationico. Le frazioni di diluizione del pool contenevano solo la singola banda di oligo RNAP causata dal legame del colorante cianine al legame oligonucleotidico, con la corsia del prodotto concentrata verso l'alto che mostrava la stessa banda, ma più scura che significa una concentrazione di up-concentration di successo.
Gli stessi modelli sono osservati dalla colorazione blu di Coomassie, con un piccolo spostamento di mobilità del gel osservato nel controllo RNAP non coniugato. Qui viene mostrato il segnale fluorescente prodotto alla fine della trascrizione in vitro in cinetica in tempo reale. In questa analisi, è stata osservata un'attivazione di 336 volte nel segnale di fluorescenza, dimostrando un robusto controllo dell'attività della polimerasi.
Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di lavare accuratamente la SDS dal gel prima della colorazione dell'acido nucleico. Questo perché STS intrappola il colorante nel gel, con conseguente segnale di fondo elevato. L'applicazione del nostro metodo a un grande circuito genico con più cascate mostrerà la scalabilità e la componibilità del sistema di trascrizione tethered.
Questa tecnica è attualmente utilizzata per sviluppare circuiti genici in grado di calcolare in stile rete neurale.
