Proponemos un método para regular la actividad de la polimerasa utilizando factores artificiales de transcripción de ácidos nucleicos. Esta arquitectura reguladora de genes puede servir como un bloque de construcción para futuros dispositivos genéticos in vitro. Al unir un dominio de unión al ADN a una ARN polimerasa T7, esta técnica combina la escalabilidad de los circuitos basados en el ADN, con la funcionalidad de los circuitos transcripcionales.
Comience por hacer nueve diluciones de oligonucleótido BG monocatenario a un volumen final de 50 microlitros de agua destilada doble, de cinco a una a una a cinco proporciones, como se indica en la tabla. Prepare una mezcla de reacción para cada dilución mezclando dos microlitros de tampón SNAP con cuatro microlitros de oligonucleótido BG y cuatro microlitros de SNAP T7 RNAP. Prepare el control de RNAP reemplazando el oligonucleótido con agua destilada doble, y el control de ADN reemplazando el SNAP T7 RNAP con agua destilada doble.
Configure 11 reacciones agregando dos microlitros de cada muestra a cuatro microlitros de tampón SNAP y dos microlitros de colorante de carga de proteínas por muestra. Calentar las reacciones durante 10 minutos a 70 grados centígrados, antes de cargar dos microlitros de cada muestra en un gel de proteína vítrea de cuatro a 12% durante 35 minutos de electroforesis en gel en hielo a 200 voltios. Al final de la carrera, lave el gel con tres intercambios de agua en un agitador durante al menos 10 minutos por lavado, seguido de tinción de ácido nucleico con tinte de cianina durante 15 minutos.
Tome una imagen del gel en un sistema de imágenes de gel apropiado y vuelva a manchar el gel con 20 mililitros de azul Coomassie. Después de una hora, desmanche con agua destilada doble durante al menos una hora antes de volver a tomar imágenes del gel. Para la purificación SNAP T7 atada a oligonucleótidos, primero, prepare el tampón de elución mezclando 50 microlitros de un trazo molar, con 100 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, con 850 microlitros de agua destilada doble.
A continuación, coloque una columna de intercambio iónico por muestra en tubos centrífugos individuales de dos mililitros, y lave las columnas con tampón de purificación por centrifugación hasta que todo el tampón haya sido eluido de cada columna. Diluya cada muestra con tampón de purificación en una relación de tampón de purificación a muestra de tres a uno, y cargue 400 microlitros de muestra en cada columna. Cuando todo el tampón haya sido eluido como se ha demostrado, recolecte y etiquete el flujo para cada muestra.
Lave las columnas tres veces con 400 microlitros de tampón de purificación por lavado hasta que todo el tampón haya sido eluido por lavado, recogiendo y etiquetando el flujo a través según corresponda. Después del último lavado, recoja la proteína eluida agregando 50 microlitros de tampón de elución en el centro de la columna y centrifugando la columna tres veces hasta que se hayan eluido los 50 microlitros de tampón. Recoger y etiquetar el eluido después de cada centrifugación, agrupando el elu en un solo tubo después de la última centrifugación, dejando un pequeño volumen de cada eluto para el análisis en gel.
Mida la absorbancia de las alícuotas elutas restantes a 260 y 280 nanómetros, y agregue glicerol a las muestras en una proporción de uno a uno para menos 20 grados de almacenamiento hasta su uso. Utilice una unidad de filtro centrifical de 500 microlitros y 30 kilodalton para intercambiar en búfer el producto eluido total con un búfer de almacenamiento 2x. Y medir la absorbancia como se demuestra.
Luego agregue glicerol al producto en una proporción de uno a uno para un almacenamiento de menos 20 grados centígrados. Para evaluar los elutos por SDS-PAGE, ejecute las muestras en una escalera de proteínas apropiada en un gel vítreo de cuatro a 12% durante 35 minutos a 200 voltios, o hasta que el frente del tinte migre al final del gel. Para demostrar la actividad de control bajo demanda del RNAP atado, mezcle 2,4 microlitros de cada plantilla con cinco microlitros de tampón de recocido 5x y 14,2 microlitros de agua destilada doble.
Incubar el resultado de un micromolar de doble cadena DNA CAGE a 75 grados Centígrados durante dos minutos. Y anneal el sentido y las cepas anti-sentido del promotor y la plantilla de ADN del aptámero verde de malaquita de la misma manera que se indica en la tabla. Al final de las incubaciones, agregue el SNAP T7 RNAP atado al ARN CAGE de doble cadena en una proporción de uno a cinco molares a una concentración final de 500 RNAP nanomolar.
Después de 15 minutos a temperatura ambiente, coloque la muestra sobre hielo y mezcle 2,5 microlitros de tampón de transcripción in vitro 10x con un microlitro de 25 milimolares ribonucleósidos trifosfato, un microlitro de un milimolar verde de malaquita, 2,5 microlitros de la mezcla RNAP CAGE, 2,5 microlitros cada uno de las hebras de oligonucleótidos de los factores de transcripción micromolares A y B, y tres microlitros de una plantilla de aptámero verde de malaquita milimolar en 10 microlitros de agua destilada doble. En 15 microlitros de agua destilada doble, configure una segunda reacción que contenga 2,5 microlitros de tampón de transcripción in vitro 10x, un microlitro de mezcla de trifosfato de ribonucleósido milimolar, un microlitro de un verde de malaquita milimolar, 2,5 microlitros de la mezcla RNAP CAGE y tres microlitros de una plantilla de aptámero verde de malaquita milimolar. Para configurar una reacción que contenga solo tampón, mezcle 2,5 microlitros de tampón de transcripción in vitro 10x, un microlitro de mezcla de trifosfato de ribonucleósido milimolar, un microlitro de un verde de malaquita milimolar y tres microlitros de una plantilla de aptámero verde de malaquita milimolar en 17,5 microlitros de agua destilada doble.
Cuando se hayan preparado todas las reacciones, transfiera cada reacción a una placa de 384 pocillos y monitoree la transcripción del aptámero verde de malaquita en un lector de placas de fluorescencia durante dos horas a 37 grados Celsius a una excitación de 610 nanómetros y una emisión de 655 nanómetros. Al final de la lectura, coloque la placa sobre hielo y ejecute el producto de ARN de cada pozo en un gel poliacrílico desnaturalizante de 12% de TBE-urea en tampón de TBE de 70 grados Celsius a 280 voltios durante 20 minutos, o hasta que el frente del tinte llegue al final del gel. Luego, manche el gel con tinción de ácido nucleico colorante cianina durante 10 minutos en un agitador orbitario, antes de obtener imágenes como se ha demostrado.
Una expresión y purificación exitosa de la proteína SNAP T7 RNAP recombinante se puede confirmar utilizando SDS-PAGE. Siguiendo SDS-PAGE, la actividad enzimática puede ser validada por reacción de transcripción in vitro. El acoplamiento exitoso de oligonucleótidos funcionalizados BG se puede verificar a través de TBE-urea PAGE de desnaturalización del 18%.
En comparación con el oligonucleótido no modificado, la adición de la fracción BG al oligonucleótido aumenta su peso molecular. Como se observa en este gel representativo de tinción de colorante de cianina para confirmar la purificación de RNAP T7 atado al ADN del exceso de oligonucleótidos BG, el flujo inicial a través de la fracción contenía principalmente un exceso de oligonucleótido BG, así como una pequeña porción de la polimerasa atada al ADN que no se unió a la resina de intercambio catiónico. Las fracciones de dilución de la piscina contenían solo la banda única de oligo RNAP causada por la unión del colorante de cianina a la correa de oligonucleótidos, con el carril del producto concentrado hacia arriba exhibiendo la misma banda, pero más oscura, lo que significa una concentración ascendente exitosa.
Los mismos patrones se observan por tinción azul de Coomassie, con un pequeño cambio de movilidad del gel observado en el control de RNAP no conjugado. Aquí, se muestra la señal fluorescente producida al final de la transcripción in vitro en cinética en tiempo real. En este análisis, se observó una activación de 336 veces en la señal de fluorescencia, demostrando un control robusto de la actividad de la polimerasa.
Al intentar este protocolo, recuerde lavar bien el SDS del gel antes de la tinción de ácido nucleico. Esto se debe a que STS atrapará el tinte en el gel, lo que resultará en una alta señal de fondo. La aplicación de nuestro método a un gran circuito genético con múltiples cascadas mostrará la escalabilidad y componibilidad del sistema de transcripción atado.
Esta técnica se está utilizando actualmente para desarrollar circuitos genéticos capaces de computación de estilo de red neuronal.
