تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح 5R01NS051305-14 و 5R01NS076980-08 إلى PJS.

1. إعداد تجريبي
<ol><li>جمع الذباب لأنها eclose في قوارير، وفصل الذباب الذكور والإناث. ملاحظة: تجرى تجارب النوم عادة مع الذباب الأنثوي. من المهم جمع الإناث العذراء. ستضع الإناث المتزاوجات البيض الذي يفقس في يرقات مما يعقد تحليل البيانات.</li>
	<li>ذباب البيت من جنس واحد في مجموعات من 20 <. ملاحظة: الإسكان الذباب في بيئة المخصب اجتماعيا (مجموعات من >50) يعدل محرك النوم6،13 القياسات التي يحتمل أن تكون محيرة من النوم انتعاش. وعلاوة على ذلك، بعد الإثراء الاجتماعي، سوف ينخفض النوم على مدى بضعة أيام6. وبالتالي ، فإن النوم الأساسي ليس مستقرا مما يعقد تحليل النوم المرتد. حفظ الذباب في مجموعات من <20 يتجنب هذا الخلط المحتمل.</li>
	<li>حافظ على الذباب في قوارير لمدة 3-5 أيام في بيئة خفيفة ورطوبة يتم التحكم فيها. ملاحظة: العمر والنضج الذباب تؤثر بقوة النوم. النوم مرتفع في الذباب القديم في يوم واحد ويستقر من قبل 3-5 أيام من سن4. وعادة ما يتم الحفاظ على الذباب على ضوء 12 ساعة: 12 ساعة جدول زمني مظلم في الرطوبة 50٪.</li>
</ol>2. إعداد أنابيب لتسجيل النوم
ملاحظة: يتم مراقبة السكون باستخدام أجهزة مراقبة النشاط الحركي. يمكن أن تحمل الشاشة 32 ذبابة موجودة بشكل فردي في أنابيب قطرها 5 مم. عادة، يتم تحليل الأنماط الجينية في مجموعات من 16 أو 32 ذبابة.
<ol><li>إعداد عدد مناسب من الأنابيب مع ذبابة الغذاء في نهاية واحدة. ملاحظة: النظام الغذائي والتمثيل الغذائي معروفة للتأثير على النوم33،34، وبالتالي فمن المهم بشكل خاص لوضع الذباب على نفس الطعام الذي تربى عليه.</li>
	<li>ختم نهاية الأنابيب بالشمع. ملاحظة: الحرمان من النوم وانتعاش هو تجربة لمدة خمسة أيام، والغذاء يمكن أن تجف إذا لم تكن مختومة بشكل صحيح. في الأنابيب المغلقة بشكل صحيح ، يمكن الحفاظ على الطعام لمدة 10 أيام أو أكثر. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لضمان أن يتم إغلاق نهايات الأنابيب بشكل جيد. الذباب يمكن أيضا أن تتعثر إلى الطعام الرطب، ومع ذلك. وهكذا، فإنه يساعد على جعل أنابيب 1-2 أيام قبل بدء التجربة.</li>
	<li>وضع الاستيقاظ بشكل فردي ، والذباب يتصرف في أنابيب زجاجية طويلة 65 ملم لتسجيل النوم باستخدام الطامح وسد نهاية الأنابيب مع سدادة رغوة. ملاحظة: الذباب لا يتعرض أبدالتخدير ثاني أكسيد الكربون عند وضع الذباب في أنابيب لتسجيل النوم. يرصد الطامح من أنابيب المطاط مع نهاية واحدة مغطاة بفرش الجبن وإدراجها في تلميح ماصة 1 مل.</li>
</ol>3. تسجيل النوم
<ol><li>تحميل الذباب في أنابيب في أجهزة مراقبة النشاط لمراقبة النوم. ملاحظة: تراقب صخور SNAP ذهابا وإيابا من -60 درجة إلى +60 درجة كل ~10 ق. وتقام الشاشات في -60 درجة ل~ 5.9s ; يستغرق ~ 2.9 ق لعلبة عقد الشاشات للانتقال من -60 درجة إلى +60 درجة و ~ 1 ق للانتقال مرة أخرى من +60° إلى -60 درجة. يمكن تغيير طول الدورة حسب الحاجة عن طريق ضبط الجهد الذي تم توفيره للمحرك.<ol>
<li>احرص على وضع الأنابيب في شاشات النشاط في الاتجاه الصحيح. في الاتجاه الصحيح ، تكون نهاية الأنبوب مع الطعام في الجزء العلوي من SNAP لضمان عدم دفع الذباب إلى الطعام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النهاية مع الطعام على جانب الشاشة مع مقبس تسجيل النوم. وهذا يسمح لشاشات النشاط أن تكون موجهة بشكل صحيح في SNAP للحرمان من النوم كفاءة مع رصد النشاط في وقت واحد.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ضع شاشات النشاط في غرفة التسجيل لمراقبة النوم.</li>
	<li>مراقبة النوم لمدة يومين كاملين على الأقل لتقدير النوم الأساسي. ملاحظة: عادة ما يتم استبعاد الذباب النهاري في شاشات النشاط كيوم للتكيف للسماح للذباب بالتكيف مع كونه موجودا في أنابيب. يتم تسجيل النوم الأساسي لمدة يومين كاملين على الأقل (48 ساعة) بدءا من الصباح التالي ليوم تحميل الذباب.</li>
	<li>حفظ عدد النشاط الحركي للذباب في صناديق دقيقة واحدة من وقت الأضواء في يوم معين إلى الأضواء في اليوم السابق باستخدام برنامج تسجيل النشاط (على سبيل المثال ، من 8 صباحا إلى 8 صباحا).</li>
	<li>تقدير النوم من بيانات النشاط الحركي مع وحدات الماكرو المخصصة باستخدام 5 دقائق من الخمول كعتتبة لنوبة من النوم35. ملاحظة: يتم حساب عدد من مقاييس السكون من عدد الأنشطة الحركية. وتشمل هذه النوم في دقيقة / ساعة أكثر من 24 ساعة، مجموع وقت النوم في 24 ساعة، متوسط والحد الأقصى نهارا وليلة النوم أطوالنوبة 36.</li>
</ol>4. الحرمان من النوم والتعافي
<ol><li>وبما أن الذباب يمكن أن يحرم من النوم لفترات زمنية متغيرة (على سبيل المثال، 12 ساعة و24 ساعة و36 ساعة) ويمكن أيضا تقييم نوم التعافي على فترات مختلفة (على سبيل المثال، 6 ح و12 ساعة و24 ساعة و48 ساعة)، حدد مدة التعافي حسب الحاجة التجريبية. يمكن تصور تعافي النوم باستخدام مؤامرة كسب/فقدان النوم أو عن طريق فحص نسبة النوم المستردة على مدى فترة زمنية محددة مسبقا (على سبيل المثال، 6 ح).</li>
	<li>إذا كان النوم مستقرا خلال اليومين الأساسيين، في اليوم الثالث، ضع مراقبي النشاط في SNAP للحرمان من النوم بين عشية وضحاها. ملاحظة: الذباب سوف تظهر انتعاش النوم قوية على مدى مجموعة من النوم مرات8،32،37،38، ولكن النوم يجب أن تكون مستقرة لتقييم موثوق النوم انتعاش. النوم مستقر عندما يكون الفرق في النوم بين أيام خط الأساس ± 100 دقيقة.</li>
	<li>تأكد من تأمين شاشات النشاط في مكانها مع دبابيس حامل الشاشة، وأسلاك الشاشة موصولة، والشاشات الموجهة بشكل صحيح مع نهاية مع الغذاء في الجزء الخلفي، والحواجز البلاستيكية في الجبهة(الشكل 1). ملاحظة: تم تصميم SNAP بحيث تدور الكاميرا مرة واحدة كل 10 s (الشكل 1). إدراج البلاستيك يعيد الأنابيب عن طريق دفع الأنابيب مرة أخرى عندما يكون الجهاز في موقف "حتى". إعادة ضبط الأنابيب مهم لضمان أن جميع الأنابيب لديها مجموعة كاملة من الحركة في بداية كل دورة.</li>
	<li>افصل شاشات النشاط، واخرج الشاشات من SNAP فور تشغيل الأضواء بعد الحرمان من النوم بين عشية وضحاها. ملاحظة: من الأهمية بمكان إنهاء الحرمان من النوم، ووضع الذباب في الانتعاش مباشرة عند الأضواء بعد 12 ساعة من الحرمان من النوم بين عشية وضحاها. حتى تأخير 20-30 دقيقة في وضع الذباب في الانتعاش يمكن أن تتداخل مع مدى انتعاش النوم.</li>
	<li>ضع الذباب في غرفة تسجيل حيث سيتم دون إزعاج لمدة يومين (48 ساعة) لمراقبة النوم الانتعاش. ملاحظة: إذا كانت غرفة التسجيل تستخدم لإجراء تجارب أخرى، يجب توخي المزيد من الحذر لتجنب تحفيز الذباب المتعافي.</li>
	<li>حساب مقدار النوم المفقود. لكل ذبابة على حدة، حساب الفرق بالساعة بين النوم التي تم الحصول عليها أثناء الحرمان من النوم والساعة المقابلة خلال خط الأساس. مجموع الاختلافات في الساعة لحساب مجموع النوم المفقودة.</li>
	<li>حساب مقدار النوم المسترد. لكل ذبابة فردية، احسب الفرق بالساعة بين النوم الذي يتم الحصول عليه أثناء التعافي والساعة المقابلة أثناء خط الأساس؛ مجموع الاختلافات في الساعة لحساب مجموع النوم المكتسبة. ملاحظة: ما إذا كان ذبابة هو في الواقع النوم المحرومين هو تجريبي. وبالتالي، يجب على المجرب فحص نسبة النوم المفقودة. إذا لم تفقد الذبابة كمية كافية من النوم ، فيمكن استبعادها من التحليل. على الرغم من أن هذا قد يكون مطلوبا لنهج الحرمان من النوم الأخرى، إلا أنه نادرا ما يكون مطلوبا من أي وقت مضى ل SNAP. أكثر شيوعا، قد لا يكون النوم مستقرا في ذبابة معينة قبل بدء الحرمان من النوم. إذا كان النوم غير مستقر، لا يمكن حساب التوازن. نحن نقبل فرقا أقصاه ± 100 دقيقة من النوم محسوبة قبل بدء الحرمان من النوم كمرشحين للإدماج. في بعض الأحيان ، يتم توزيع نوم الذبابة الفردية بشكل غير متساو عبر يوم 24 ساعة (على سبيل المثال ، قد يحصل بعض الأفراد على 60-70٪ من حصة نومهم خلال النهار وبالتالي يفقدون نسبة صغيرة فقط من حصتهم من النوم البالغة 24 ساعة عند حرمانهم لمدة 12 ساعة في الليل). يمكن تقييم هذه الذبابات بشكل منفصل.</li>
	<li>حساب متوسط نسبة النوم المسترد (بالنسبة لخط الأساس) على مدى 12 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة من فترة التعافي لكل نمط جيني.</li>
	<li>من بيانات النوم، احسب متوسط وأقصى طول نوبة نوم نهارية على خط الأساس، وأيام التعافي لكل نمط جيني. ملاحظة: يتميز النوم المرتد في الذباب بزيادة كمية النوم وزيادة عمق النوم في أيام التعافي. يستخدم دمج النوم كمقياس لعمق النوم. ويمكن أيضا أن تستخدم عتبات الإثارة كمقياس لعمق النوم.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nath, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Jellyfish+Cassiopea+Exhibits+a+Sleep-like+State.">The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State.</a> Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).</li><li>Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sleep+in+Aplysia+californica.">Characterization of sleep in Aplysia californica.</a> Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+promotes+sleep-like+state+in+zebrafish.">Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish.</a> Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).</li><li>Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waking+experience+affects+sleep+need+in+Drosophila.">Waking experience affects sleep need in Drosophila.</a> Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+receptor+activation+in+the+mushroom+bodies+rescues+sleep-loss-induced+learning+impairments+in+Drosophila.">D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila.</a> Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).</li><li>Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+sleep+by+remote+control+facilitates+memory+consolidation+in+Drosophila.">Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).</li><li>Seidner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Neurons+with+a+Privileged+Role+in+Sleep+Homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).</li><li>Li, X., Yu, F., Guo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+specifically+impairs+short-term+olfactory+memory+in+Drosophila.">Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila.</a> Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).</li><li>Melnattur, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+sleep+in+supporting+Spatial+Learning+in+Drosophila.">A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila.</a> Sleep. , 197 (2020).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+during+early-adult+development+results+in+long-lasting+learning+deficits+in+adult+Drosophila.">Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila.</a> Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).</li><li>Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use-dependent+plasticity+in+clock+neurons+regulates+sleep+need+in+Drosophila.">Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 105-108 (2009).</li><li>Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+synaptic+homeostasis:+structural+evidence+in+Drosophila.">Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).</li><li>Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., G&#246;tz, T., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Active+Zone+Plasticity+Encodes+Sleep+Need+in+Drosophila.">Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila.</a> Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).</li><li>Kirszenblat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+regulates+visual+selective+attention+in+Drosophila.">Sleep regulates visual selective attention in Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Singh, P., Donlea, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Regulation+of+Sleep+and+Synapse+Pruning+after+Neural+Injury.">Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury.</a> Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).</li><li>Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Regulates+Glial+Plasticity+and+Expression+of+the+Engulfment+Receptor+Draper+Following+Neural+Injury.">Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury.</a> Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).</li><li>Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+of+sleep+for+development+of+courtship+circuitry+and+behavior+in+Drosophila.">A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila.</a> Science. 344 (6181), 269-274 (2014).</li><li>Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+suppresses+aggression+in+Drosophila.">Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila.</a> Elife. 4, 07643 (2015).</li><li>Szuperak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sleep+state+in+Drosophila+larvae+required+for+neural+stem+cell+proliferation.">A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Vaccaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Loss+Can+Cause+Death+through+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Gut.">Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut.</a> Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).</li><li>Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potassium+channel+&#946;-subunit+couples+mitochondrial+electron+transport+to+sleep.">A potassium channel &#946;-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep.</a> Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).</li><li>Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+machinery+of+sleep+homeostasis+in+Drosophila.">Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).</li><li>Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Drive+Is+Encoded+by+Neural+Plastic+Changes+in+a+Dedicated+Circuit.">Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit.</a> Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).</li><li>Pimentel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operation+of+a+homeostatic+sleep+switch.">Operation of a homeostatic sleep switch.</a> Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).</li><li>Sitaraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Homeostatic+Sleep+Signals+by+Segregated+Synaptic+Microcircuits+of+the+Drosophila+Mushroom+Body.">Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body.</a> Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).</li><li>Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+and+ERK+by+rhomboid+signaling+regulates+the+consolidation+and+maintenance+of+sleep+in+Drosophila.">Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+modulates+sleep+homeostasis+and+learning+after+sleep+deprivation+in+Drosophila.">Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila.</a> Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).</li><li>Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+short-term+memory+defects+following+sleep+deprivation+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease.">Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).</li><li>Tabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+interacts+with+a&#946;+to+modulate+intrinsic+neuronal+excitability.">Sleep interacts with a&#946; to modulate intrinsic neuronal excitability.</a> Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).</li><li>Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+flight+increases+sleep+and+identifies+a+novel+sleep-promoting+pathway+in+Drosophila.">Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila.</a> Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).</li><li>Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perilipin+homologue,+lipid+storage+droplet+2,+regulates+sleep+homeostasis+and+prevents+learning+impairments+following+sleep+loss.">The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss.</a> PLOS Biology. 8 (8), (2010).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+and+cycle+limit+starvation-induced+sleep+loss+in+Drosophila.">Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).</li><li>Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+genes+protect+against+lethal+effects+of+sleep+deprivation+in+Drosophila.">Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila.</a> Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).</li><li>Andretic, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila:+moving+beyond+sleep+time.">Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+sleep+regulatory+genes+using+a+Drosophila+model+of+insomnia.">Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia.</a> Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).</li><li>Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Hyperkinetic+mutants+have+reduced+sleep+and+impaired+memory.">Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory.</a> Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).</li><li>Geissmann, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethoscopes:+An+open+platform+for+high-throughput+ethomics.">Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics.</a> PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

النوم في Drosophila يتميز بشكل مستقل في عام 2000 ، من قبل مجموعتين4،5. في هذه الدراسات الرائدة، حرم الذباب من النوم عن طريق التعامل اللطيف (أي الحرمان من اليد) وأظهر أنه يظهر استجابة قوية للحرمان من النوم بين عشية وضحاها. الأهم من ذلك ، مع أي تجربة الحرمان من الن?...

النوم هو شبه عالمي في الحيوانات، ومع ذلك وظيفتها لا تزال غير واضحة. التوازن النومي، الزيادة التعويضية في النوم بعد الحرمان من النوم، هو خاصية مميزة للنوم، التي تم استخدامها لتوصيف حالات النوم في عدد منالحيوانات 1،2،3،4،5.
النوم في ذبابة لديه العديد من أوجه التشابه مع النوم البشري، بما في ذلك استجابة قوية homeostatic لفقدان النوم4،5. وقد استخدمت العديد من الدراسات للنوم في ذبابة الحرمان من النوم على حد سواء لاستنتاج وظيفة النوم من خلال دراسة العواقب السلبية التي تتراكم من الاستيقاظ الموسعة، وفهم تنظيم النوم من خلال تحديد الآليات العصبية البيولوجية التي تتحكم في تنظيم الهوستاتيكي للنوم. وهكذا تبين الذباب المحروم من النوم لإظهار العاهات في التعلم والذاكرة6، 7،8،9،10،11،12، اللدونة الهيكلية13،14،15، الاهتمام البصري16، الشفاء من إصابة الخلايا العصبية17،18، التزاوج والسلوكيات العدوانية19، 20, انتشار الخلايا21, والاستجابات للإجهاد التأكسدي22,23 على سبيل المثال لا الحصر. وعلاوة على ذلك، أسفرت التحقيقات في آليات البيولوجيا العصبية السيطرة على النوم انتعاش رؤى حرجة في الآلات العصبية التي تشكل homeostat النوم8،9،23،24،25،26،27،28،29 . وأخيرا، بالإضافة إلى الكشف عن رؤى أساسية في وظيفة النوم في الحيوانات السليمة، وقد أبلغت دراسات الحرمان من النوم أيضا رؤى في وظيفة النوم في الدول المريضة30،31.
في حين أن الحرمان من النوم هو بلا شك أداة قوية ، مع أي تجربة الحرمان من النوم ، من المهم التمييز بين الأنماط الظاهرية التي تنتج عن الاستيقاظ الممتد ، من تلك الناجمة عن التحفيز المستخدم للحفاظ على الحيوان مستيقظا. الحرمان من النوم عن طريق الحرمان من اليد أو التعامل اللطيف ، ويعتبر عموما وضع معيار للحرمان من النوم التخريبية الحد الأدنى. هنا نصف بروتوكولا ل الذباب المحروم من النوم باستخدام جهاز إبطال النوم (SNAP). وSNAP هو الجهاز الذي يسلم التحفيز الميكانيكية للذباب كل 10s، والحفاظ على الذباب مستيقظا عن طريق تحفيز geotaxis السلبية (الشكل 1). وSNAP يحرم بكفاءة الذباب من >98٪ من النوم ليلا، حتى في الذباب مع ارتفاع محرك النوم8،32. وقد تم معايرة SNAP على الذباب الحساس الانفجار، والتحريض من الذباب في SNAP لا يضر الذباب. الحرمان من النوم مع SNAP يحفز انتعاش مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق الحرمان من اليد7. وبالتالي فإن SNAP هو طريقة قوية للنوم يحرم الذباب أثناء التحكم في آثار التحفيز المثير.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Locomotor activity tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Tissue Prep Wax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13404-122</td>
			<td>Wax used for sealing tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>Wale Apparatus</td>
			<td>244050</td>
			<td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&#160;tubes into 65mm long tubes&#160;to record sleep. Pre-cut tubes&#160;can also be purchased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-113</td>
			<td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary glass cutting tool</td>
			<td>Dremel Multi Pro</td>
			<td>395</td>
			<td>Used to cut 65mm long glass tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring Sleep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM System and DAMFileScan software</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td></td>
			<td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>Idea Centre AIO3</td>
			<td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Activity Monitors</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>DAM2</td>
			<td>These monitors are used to record flies&#39; locomotor activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environment Monitor</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>DEnM</td>
			<td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Controller</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>LC4</td>
			<td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply Interface Unit for DAM</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>PSIU-9</td>
			<td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RJ11 connector</td>
			<td>7001-64PC</td>
			<td>Multicomp</td>
			<td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitters</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>SPLT5</td>
			<td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telephone cable wire</td>
			<td>Radioshack</td>
			<td>278-367</td>
			<td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleep Deprivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Gw INSTEK</td>
			<td>GPS-30300</td>
			<td>Power supply for the SNAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleep Nullifying Apparatus</td>
			<td>Washington University School of Medicine machine shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

التوازن النوم، والزيادة في النوم لوحظ بعد فقدان النوم، هي واحدة من المعايير المحددة المستخدمة لتحديد النوم في جميع أنحاء المملكة الحيوانية. ونتيجة لذلك، فإن الحرمان من النوم وتقييد النوم هما أداتان قويتان تستخدمان عادة لتوفير نظرة ثاقبة على وظيفة النوم. ومع ذلك، فإن تجارب الحرمان من النوم إشكالية بطبيعتها من حيث أن حافز الحرمان نفسه قد يكون السبب في التغيرات الملحوظة في علم وظائف الأعضاء والسلوك. وبناء على ذلك، ينبغي أن تبقي تقنيات الحرمان من النوم الناجحة الحيوانات مستيقظة، ومن الناحية المثالية، تؤدي إلى انتعاش قوي في النوم دون أن تؤدي أيضا إلى عدد كبير من العواقب غير المقصودة. هنا، ونحن نصف تقنية الحرمان من النوم لDrosophila الميلانوغاستر. جهاز إبطال النوم (SNAP) يدير حافزا كل 10s للحث على geotaxis السلبية. على الرغم من أن التحفيز يمكن التنبؤ به ، إلا أن SNAP يمنع بشكل فعال >95٪ من النوم الليلي حتى في الذباب مع محرك الأقراص عالي النوم. والأهم من ذلك أن الاستجابة اللاحقة للنواس الساكنة تشبه إلى حد كبير الاستجابة التي تحققت باستخدام الحرمان اليدوي. يمكن تعديل توقيت المحفزات والمباعدة بينها لتقليل فقدان النوم وبالتالي فحص الآثار غير المحددة للتحفيز على علم وظائف الأعضاء والسلوك. يمكن أيضا استخدام SNAP للحد من النوم وتقييم عتبات الإثارة. وSNAP هو تقنية قوية اضطراب النوم التي يمكن استخدامها لفهم أفضل وظيفة النوم.

كانتون S (CS) كان يستخدم سلسلالات من النوع البري. تم الحفاظ على الذباب على ضوء 12 ساعة: 12 ساعة جدول زمني مظلم، والنوم المحرومين لمدة 12 ساعة بين عشية وضحاها. التفتيش على ملامح النوم من الذباب CS في يوم خط الأساس (بس), يوم الحرمان من النوم (SD), ويومين الانتعاش (rec1 و rec2) (ال?...

Watch this Scientific Journal Video about The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila at JoVE.com

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

الحرمان من النوم هو أداة قوية للتحقيق في وظيفة النوم والتنظيم. نحن نصف بروتوكول النوم يحرم دروسوفيلا باستخدام جهاز إبطال النوم ، وتحديد مدى انتعاش النوم الناجم عن الحرمان.

جهاز إبطال النوم: طريقة فعالة للغاية لحرمان الدروزوفيلا من النوم

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

the-sleep-nullifying-apparatus-highly-efficient-method-sleep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.3K Views.  Washington University School of Medicine. الحرمان من النوم هو أداة قوية للتحقيق في وظيفة النوم والتنظيم. نحن نصف بروتوكول النوم يحرم دروسوفيلا باستخدام جهاز إبطال النوم ، وتحديد مدى انتعاش النوم الناجم عن الحرمان.

Video: The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

رواية جهاز وطريقة لتدعيم المخدرات

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

يعاير نشاط الحركي لدراسة ايقاعات كل يوم والمعلمات في النوم ذبابة الفاكهة</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

وهناك طريقة العقداء العقد حقن في سبراغ داولي الفئران

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

طريقة لإلحاق رئيس مقفلة إصابات الدماغ في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

تسجيل الطباعة الداخلي لقياس النوم في الفئران

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

التلاعب الجيني البصري للدوائر العصبية أثناء مراقبة حالات النوم/اليقظة في الفئران

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

How to Obtain Reliable Visual Event-related Potentials in Newborns

The present study discusses the characteristics of visual event-related potentials (VEPs) and outlines methodological steps for obtaining reliable measurements in newborns. Obtaining high-quality, reliable VEPs is crucial for the early detection of abnormal development of the central nervous system in at-risk newborns, and for implementing successful early interventions. Recommendations are based on a previous study which showed that when post-conceptional age, polysomnography-identified sleep stages, and light-emitting diodes (LEDs) googles as the luminous source are controlled, no more than 4 repetitions of VEP averages are required to obtain replicable recordings, variability decreases, and reliable VEPs can be obtained. By controlling for these sources of variability and using statistical analyses, we were able to clearly and reliably identify the amplitude and latency of three main components (NII, PII and NIII) present in 100% of newborns (n = 20) during active sleep. Recording VEPs during awake states, quiet sleep and transitional sleep is not recommended because VEP morphology may differ significantly from one average to the next, leading to the risk of misleading clinical prognoses. Moreover, it is easier to obtain VEPs during active sleep because this state can be clearly and reliably identified at this stage of development, sleep cycles are short enough to allow measurements to be taken in a reasonable time, and the method does not require new o expensive equipment.

Several important points for obtaining high-quality reliable visual evoked potentials (VEPs) in newborns while minimizing variability and the risk of misleading prognoses are presented.