Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse 5R01NS051305-14 und 5R01NS076980-08 an PJS unterstützt.

1. Experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie Fliegen, während sie sich in Fläschchen verwandeln und männliche und weibliche Fliegen trennen. HINWEIS: Schlafexperimente werden häufig mit weiblichen Fliegen durchgeführt. Es ist wichtig, jungfräuliche Weibchen zu sammeln. Gepaarte Weibchen legen Eier, die zu Larven schlüpfen, was die Analyse der Daten erschwert.</li>
	<li>Hausfliegen eines geschlechts geschlechts in Gruppen von <20. HINWEIS: Die Unterbringung von Fliegen in einer sozial angereicherten Umgebung (Gruppen von >50) moduliert den Schlafantrieb6,13 potenziell verwirrende Messungen des Rebound-Schlafes. Darüber hinaus wird der Schlaf nach sozialer Bereicherung über einige Tage abnehmen6. Daher ist der Ausgangsschlaf nicht stabil, was die Analyse des Rebound-Schlafes erschwert. Das Halten von Fliegen in Gruppen von <20 vermeidet dieses potenzielle Verwechslung.</li>
	<li>Halten Sie Fliegen in Fläschchen für 3-5 Tage in einer licht- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung. HINWEIS: Alter und Reife von Fliegen beeinflussen den Schlaf stark. Der Schlaf ist bei einem Tag alten Fliegen hoch und stabilisiert sich um 3-5 Tage im Alter von4 Jahren. Fliegen werden typischerweise auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan bei 50% Luftfeuchtigkeit gehalten.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Schläuchen für die Schlafaufzeichnung
HINWEIS: Der Schlaf wird mit Bewegungsaktivitätsmonitoren überwacht. Ein Monitor kann 32 Fliegen aufnehmen, die einzeln in Rohren mit einem Durchmesser von 5 mm untergebracht sind. Typischerweise werden Genotypen in Gruppen von 16 oder 32 Fliegen analysiert.
<ol><li>Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Röhrchen mit Fliegenfutter an einem Ende vor. HINWEIS: Es ist bekannt, dass Ernährung und Stoffwechsel den Schlaf beeinflussen33,34, daher ist es besonders wichtig, Fliegen auf die gleiche Nahrung zu legen, auf der sie aufgezogen wurden.</li>
	<li>Versiegeln Sie das Ende der Röhrchen mit Wachs. HINWEIS: Schlafentzug und Rebound ist ein fünftägiges Experiment, und Lebensmittel können austrocknen, wenn sie nicht richtig versiegelt sind. In ordnungsgemäß verschlossenen Röhrchen können Lebensmittel 10 Tage oder mehr gehalten werden. Daher ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Enden der Rohre gut abgedichtet sind. Fliegen können jedoch auch an Nassfutter hängen bleiben. So hilft es, Röhren 1-2 Tage vor Beginn des Experiments herzustellen.</li>
	<li>Wake, Behaving Fliegen einzeln in 65 mm lange Glasröhren zur Schlafaufzeichnung mit einem Absauger legen und das Ende der Schläuche mit einem Schaumstoffstopper verstopfen. HINWEIS: Fliegen werden niemals wieder einer CO2-Anästhesie ausgesetzt, wenn Fliegen zur Schlafaufzeichnung in Schläuche gelegt werden. Der Absauger besteht aus Gummischläuchen, wobei ein Ende mit einem Käsetuch bedeckt und in eine 1 mL Pipettenspitze eingeführt wird.</li>
</ol>3. Schlaf aufzeichnen
<ol><li>Load fliegt in Röhren in Aktivitätsmonitore, um den Schlaf zu überwachen. HINWEIS: Die SNAP-Felsen überwachen alle ~10 s von -60° bis +60° hin und her. Die Monitore werden bei -60° für ~5,9s gehalten; Es dauert ~2,9 s, bis sich das Fach, in dem die Monitore gehalten werden, von -60° auf +60° bewegt und ~1 s, um sich von +60° auf -60° zurückzubewegen. Die Zykluslänge kann nach Bedarf durch Anpassung der dem Motor zugeführten Spannung geändert werden.<ol>
<li>Achten Sie darauf, dass die Röhren in der richtigen Ausrichtung in Aktivitätsmonitoren platziert werden. In der richtigen Ausrichtung befindet sich das Ende der Röhre mit Nahrung an der Oberseite des SNAP, um sicherzustellen, dass Fliegen nicht in die Nahrung gedrückt werden. Darüber hinaus befindet sich das Ende mit Essen an der Seite des Monitors mit der Schlafaufzeichnungsbuchse. Auf diese Weise können Aktivitätsmonitore im SNAP für einen effizienten Schlafentzug richtig ausgerichtet werden und gleichzeitig die Aktivität überwacht werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie Aktivitätsmonitore in der Aufzeichnungskammer, um den Schlaf zu überwachen.</li>
	<li>Überwachen Sie den Schlaf für mindestens zwei volle Tage, um den Ausgangsschlaf abzuschätzen. HINWEIS: Der Tag, an dem Fliegen in Aktivitätsmonitore geladen werden, ist in der Regel als Anpassungstag ausgeschlossen, damit sich die Fliegen an die Unterbringung in Röhren anpassen können. Der Ausgangsschlaf wird für mindestens zwei volle Tage (48 Stunden) aufgezeichnet, beginnend mit dem Morgen nach dem Tag, an dem fliegen geladen werden.</li>
	<li>Speichern Sie die Anzahl der Bewegungsaktivität von Fliegen in 1-Minuten-Behältern von der Zeit der Lichter an einem bestimmten Tag bis zur Beleuchtung am Vortag mit einer Aktivitätsaufzeichnungssoftware (z. B. von 8 Uhr morgens bis 8 Uhr morgens).</li>
	<li>Schätzen Sie den Schlaf aus den Bewegungsaktivitätsdaten mit benutzerdefinierten Makros unter Verwendung von 5 Minuten Inaktivität als Schwellenwert für einen Schlafanfall35. HINWEIS: Aus den Zählungen der Bewegungsaktivität werden eine Reihe von Schlafmetriken berechnet. Dazu gehören Schlaf in min / h über 24 h, Gesamtschlafzeit in 24 h, durchschnittliche und maximale Tages- und Nachtschlaflängen36.</li>
</ol>4. Schlafentzug und Erholung
<ol><li>Da Fliegen für variable Zeiträume (z. B. 12 h, 24 h und 36 h) schlaflos werden können und der Erholungsschlaf auch in verschiedenen Intervallen (z. B. 6 h, 12 h, 24 h und 48 h) bewertet werden kann, bestimmen Sie die Dauer der Genesung durch experimentellen Bedarf. Die Schlaferholung kann mit einem Schlafgewinn-/-verlust-Diagramm oder durch Untersuchung des prozentualen Schlafes, der über ein vorgegebenes Intervall (z. B. 6 Stunden) wiederhergestellt wurde, visualisiert werden.</li>
	<li>Wenn der Schlaf an den beiden Basistagen stabil ist, platzieren Sie am dritten Tag Aktivitätsmonitore für Schlafentzug über Nacht im SNAP. HINWEIS: Fliegen zeigen einen robusten Schlaf-Rebound über einen Bereich von Schlafzeiten8,32,37,38, aber der Schlaf muss stabil sein, um den Rebound-Schlaf zuverlässig zu bewerten. Der Schlaf ist stabil, wenn der Schlafunterschied zwischen den Basistagen ± 100 Minuten beträgt.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass Aktivitätsmonitore mit Monitorhalterstiften, eingesteckten Monitorkabeln und korrekt ausgerichteten Monitoren mit dem Ende mit Lebensmitteln auf der Rückseite und Kunststoffbarrieren vorne gesichert sind (Abbildung 1). HINWEIS: Der SNAP ist so konzipiert, dass sich der Nocken alle 10 s dreht (Abbildung 1). Der Kunststoffeinsatz setzt die Schläuche zurück, indem er die Schläuche zurückdrückt, wenn sich das Gerät in der Position "oben" befindet. Das Zurücksetzen der Rohre ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle Rohre zu Beginn jedes Zyklus den vollen Bewegungsumfang haben.</li>
	<li>Trennen Sie die Aktivitätsmonitore und nehmen Sie die Monitore sofort aus dem SNAP, sobald die Lichter nach schlafentzug über Nacht eingeschaltet sind. HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Schlafentzug beendet wird und die Fliegen sofort nach 12 Stunden Schlafentzug über Nacht in die Genesung versetzt werden. Selbst eine Verzögerung von 20-30 Minuten beim Einsetzen von Fliegen in die Genesung kann das Ausmaß des Rebound-Schlafes beeinträchtigen.</li>
	<li>Legen Sie Fliegen in eine Aufnahmekammer, wo sie zwei Tage (48 h) ungestört sind, um den Erholungsschlaf zu überwachen. HINWEIS: Wenn die Aufnahmekammer für andere Experimente verwendet wird, muss besonders darauf geachtet werden, dass sich die Fliegen nicht stimulieren.</li>
	<li>Berechnen Sie die Menge des verlorenen Schlafes. Berechnen Sie für jede einzelne Fliege die stündliche Differenz zwischen dem Schlaf, der während des Schlafentzugs erhalten wird, und der entsprechenden Stunde während des Ausgangswerts. Summieren Sie die stündlichen Differenzen, um den gesamten verlorenen Schlaf zu berechnen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Menge des wiederhergestellten Schlafes. Berechnen Sie für jede einzelne Fliege die stündliche Differenz zwischen dem Schlaf, der während der Erholung erhalten wird, und der entsprechenden Stunde während des Ausgangswerts. Summieren Sie die stündlich gewonnenen Differenzen, um den gesamten Schlaf zu berechnen. HINWEIS: Ob eine Fliege tatsächlich unter Schlafentzug liegt, ist empirisch. Daher sollte der Experimentator den prozentualen Schlafverlust untersuchen. Wenn die Fliege nicht genügend Schlaf verloren hat, kann sie von der Analyse ausgeschlossen werden. Obwohl dies für andere Schlafentzugsansätze erforderlich sein kann, ist es selten, wenn überhaupt, für den SNAP erforderlich. Häufiger kann der Schlaf in einer bestimmten Fliege vor Beginn des Schlafentzugs nicht stabil sein. Wenn der Schlaf nicht stabil ist, kann die Homöostase nicht berechnet werden. Wir akzeptieren eine maximale Differenz von ± 100 Minuten Schlaf, die vor Beginn des Schlafentzugs berechnet wurde, als Kandidaten für die Aufnahme. Gelegentlich ist der Schlaf einer einzelnen Fliege ungleichmäßig über den 24-Stunden-Tag verteilt (z. B. können einige Personen 60-70% ihrer Schlafquote während des Tages erhalten und somit nur einen kleinen Teil ihrer 24-Stunden-Schlafquote verlieren, wenn sie nachts 12 Stunden lang entzogen werden). Diese Fliegen können separat bewertet werden.</li>
	<li>Berechnen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz des Schlafes (relativ zum Ausgangswert) über 12 h, 24 h und 48 h der Erholungsphase für jeden Genotyp.</li>
	<li>Berechnen Sie anhand von Schlafdaten die durchschnittliche und maximale Tagesschlafdauer auf der Basislinie und die Erholungstage für jeden Genotyp. HINWEIS: Rebound-Schlaf bei Fliegen ist durch erhöhte Schlafmenge und erhöhte Schlaftiefe in den Erholungstagen gekennzeichnet. Die Schlafkonsolidierung wird als Maß für die Schlaftiefe verwendet. Erregungsschwellen könnten auch als Maß für die Schlaftiefe verwendet werden.</li>
</ol>

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	<li>Nath, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Jellyfish+Cassiopea+Exhibits+a+Sleep-like+State.">The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State.</a> Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).</li><li>Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sleep+in+Aplysia+californica.">Characterization of sleep in Aplysia californica.</a> Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waking+experience+affects+sleep+need+in+Drosophila.">Waking experience affects sleep need in Drosophila.</a> Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+receptor+activation+in+the+mushroom+bodies+rescues+sleep-loss-induced+learning+impairments+in+Drosophila.">D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila.</a> Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).</li><li>Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+sleep+by+remote+control+facilitates+memory+consolidation+in+Drosophila.">Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).</li><li>Seidner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Neurons+with+a+Privileged+Role+in+Sleep+Homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).</li><li>Li, X., Yu, F., Guo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+specifically+impairs+short-term+olfactory+memory+in+Drosophila.">Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila.</a> Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).</li><li>Melnattur, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+sleep+in+supporting+Spatial+Learning+in+Drosophila.">A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila.</a> Sleep. , 197 (2020).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+during+early-adult+development+results+in+long-lasting+learning+deficits+in+adult+Drosophila.">Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila.</a> Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).</li><li>Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use-dependent+plasticity+in+clock+neurons+regulates+sleep+need+in+Drosophila.">Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 105-108 (2009).</li><li>Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+synaptic+homeostasis:+structural+evidence+in+Drosophila.">Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).</li><li>Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., G&#246;tz, T., Sigrist, S. 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M., Talbot, C. B., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potassium+channel+&#946;-subunit+couples+mitochondrial+electron+transport+to+sleep.">A potassium channel &#946;-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep.</a> Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).</li><li>Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+machinery+of+sleep+homeostasis+in+Drosophila.">Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).</li><li>Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila:+moving+beyond+sleep+time.">Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+sleep+regulatory+genes+using+a+Drosophila+model+of+insomnia.">Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia.</a> Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).</li><li>Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Hyperkinetic+mutants+have+reduced+sleep+and+impaired+memory.">Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory.</a> Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).</li><li>Geissmann, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethoscopes:+An+open+platform+for+high-throughput+ethomics.">Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics.</a> PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Schlaf in Drosophila wurde unabhängig voneinander im Jahr 2000 durch zwei Gruppen4,5charakterisiert. In diesen bahnbrechenden Studien wurde Fliegen durch sanfte Handhabung (d.h. Händeentzug) des Schlafes beraubt und gezeigt, dass sie eine robuste homöostatische Reaktion auf Schlafentzug über Nacht zeigen. Wichtig ist, dass es bei jedem Schlafentzugsexperiment entscheidend ist, mögliche verwirrende Auswirkungen der Methode zu kontrollieren, mit der d...

Schlaf ist bei Tieren nahezu universell, aber seine Funktion bleibt unklar. Schlaföostase, die kompensatorische Zunahme des Schlafes nach Schlafentzug, ist eine definierende Eigenschaft des Schlafes, die verwendet wurde, um Schlafzustände bei einer Reihe von Tieren1,2,3,4,5zu charakterisieren .
Schlaf in der Fliege hat viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Schlaf, einschließlich einer robusten homöostatischen Reaktion auf Schlafverlust4,5. Zahlreiche Studien über schlaf in der Fliege haben Schlafentzug verwendet, um sowohl die Schlaffunktion abzuleiten, indem die nachteiligen Folgen eines längeren Aufwachens untersucht werden, als auch um die Schlafregulation zu verstehen, indem die neurobiologischen Mechanismen bestimmt werden, die die homöostatische Regulierung des Schlafes steuern. So wurde gezeigt, dass schlaflose Fliegen Beeinträchtigungen im Lern- und Gedächtnis aufweisen6,7,8,9,10,11,12, strukturelle Plastizität13,14,15, visuelle Aufmerksamkeit16, Erholung von neuronalen Verletzungen17,18, Paarung und aggressives Verhalten19, 20, Zellproliferation21und Reaktionen auf oxidativen Stress22,23, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus haben Untersuchungen der neurobiologischen Mechanismen, die den Rebound-Schlaf steuern, kritische Einblicke in die neuronale Maschinerie geliefert, die den Schlaf-Homöostaten8,9,23,24,25,26,27,28,29 bildet. . Schließlich haben Studien zur Schlafentzug nicht nur grundlegende Einblicke in die Schlaffunktion bei gesunden Tieren, sondern auch Erkenntnisse über die Schlaffunktion in erkrankten Zuständen30,31.
Während Schlafentzug unbestreitbar ein mächtiges Werkzeug ist, ist es bei jedem Schlafentzugsexperiment wichtig, Phänotypen, die aus längerem Aufwachen resultieren, von denen zu unterscheiden, die durch den Reiz induziert werden, der verwendet wird, um das Tier wach zu halten. Schlafentzug durch Händeentzug oder sanfte Handhabung gilt allgemein als Standard für minimal störenden Schlafentzug. Hier beschreiben wir ein Protokoll für schlafentziehende Fliegen mit dem Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Das SNAP ist ein Gerät, das alle 10Er Jahre einen mechanischen Reiz an Fliegen liefert und Fliegen wach hält, indem es negative Geotaxis induziert (Abbildung 1). Der SNAP entzieht Fliegen effizient >98% des Nachtschlafs, auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb8,32. Der SNAP wurde auf knallempfindliche Fliegen kalibriert, das Rühren von Fliegen im SNAP schadet den Fliegen nicht; Schlafentzug mit dem SNAP induziert einen Rebound, der mit dem durch Handentzug7vergleichbar ist. Der SNAP ist somit eine robuste Methode, um Fliegen zu schlafentziehen und gleichzeitig die Wirkung des erregenden Reizes zu kontrollieren.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Locomotor activity tubes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue Prep Wax</td><td>Thermo Fisher</td><td>13404-122</td><td>Wax used for sealing tubes</td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>Wale Apparatus</td><td>244050</td><td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&amp;nbsp;tubes into 65mm long tubes&amp;nbsp;to record sleep. Pre-cut tubes&amp;nbsp;can also be purchased.</td></tr><tr><td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-113</td><td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td></tr><tr><td>Rotary glass cutting tool</td><td>Dremel Multi Pro</td><td>395</td><td>Used to cut 65mm long glass tubes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Monitoring Sleep&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAM System and DAMFileScan software</td><td>Trikinetics</td><td></td><td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td></tr><tr><td>Data acquisition computer</td><td>Lenovo</td><td>Idea Centre AIO3</td><td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td></tr><tr><td>Drosophila Activity Monitors</td><td>Trikinetics</td><td>DAM2</td><td>These monitors are used to record flies&#039; locomotor activity</td></tr><tr><td>Environment Monitor</td><td>Trikinetics</td><td>DEnM</td><td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td></tr><tr><td>Light Controller</td><td>Trikinetics</td><td>LC4</td><td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td></tr><tr><td>Power Supply Interface Unit for DAM</td><td>Trikinetics</td><td>PSIU-9</td><td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td></tr><tr><td>RJ11 connector</td><td>7001-64PC</td><td>Multicomp</td><td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td></tr><tr><td>Splitters</td><td>Trikinetics</td><td>SPLT5</td><td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td></tr><tr><td>Telephone cable wire</td><td>Radioshack</td><td>278-367</td><td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sleep Deprivation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Gw INSTEK</td><td>GPS-30300</td><td>Power supply for the SNAP</td></tr><tr><td>Sleep Nullifying Apparatus</td><td>Washington University School of Medicine machine shop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

Die Schlaföostase, die Zunahme des Schlafes, die nach Schlafverlust beobachtet wird, ist eines der definierenden Kriterien, um den Schlaf im gesamten Tierreich zu identifizieren. Infolgedessen sind Schlafentzug und Schlafeinschränkung leistungsstarke Werkzeuge, die häufig verwendet werden, um Einblicke in die Schlaffunktion zu geben. Nichtsdestotrotz sind Schlafentzugsexperimente von Natur aus problematisch, da der Entzugsreiz selbst die Ursache für beobachtete Veränderungen in Physiologie und Verhalten sein kann. Dementsprechend sollten erfolgreiche Schlafentzugstechniken die Tiere wach halten und im Idealfall zu einem robusten Schlafrebound führen, ohne auch eine Vielzahl unbeabsichtigter Folgen zu verursachen. Hier beschreiben wir eine Schlafentzugstechnik für Drosophila melanogaster. Der Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) verabreicht alle 10er Jahre einen Stimulus, um negative Geotaxis zu induzieren. Obwohl der Reiz vorhersehbar ist, verhindert der SNAP effektiv >95% des Nachtschlafs auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb. Wichtig ist, dass die nachfolgende homöostatische Reaktion der durch Handentzug erreichten sehr ähnlich ist. Das Timing und der Abstand der Reize können modifiziert werden, um den Schlafverlust zu minimieren und somit unspezifische Auswirkungen des Reizes auf Physiologie und Verhalten zu untersuchen. Der SNAP kann auch zur Schlafeinschränkung und zur Beurteilung von Erregungsschwellen eingesetzt werden. Der SNAP ist eine leistungsstarke Schlafunterbrechungstechnik, mit der die Schlaffunktion besser verstanden werden kann.

Canton S (Cs) wurde als Wildtyp-Stamm verwendet. Fliegen wurden auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan gehalten und Schlaf für 12 Stunden über Nacht entzogen. Die Untersuchung der Schlafprofile von Cs-Fliegen am Basistag (bs), am Schlafentzugstag (sd) und an zwei Erholungstagen (rec1 und rec2)(Abbildung 2A)legt nahe, dass Fliegen im SNAP effektiv Schlaf entzogen wurden und der Schlaf während des Tages im Einklang mit den beobachteten Berichten in der...

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The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

Schlafentzug ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Schlaffunktion und -regulierung zu untersuchen. Wir beschreiben ein Protokoll, um Drosophila mit dem Schlafnullierungsapparat zu schlafen und das Ausmaß des durch Entzug induzierten Rebound-Schlafes zu bestimmen.

Der Schlaf-Nullifizierungsapparat: Eine hocheffiziente Methode zur Schlafentzugs-Drosophila

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

the-sleep-nullifying-apparatus-highly-efficient-method-sleep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.3K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Schlafentzug ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Schlaffunktion und -regulierung zu untersuchen. Wir beschreiben ein Protokoll, um Drosophila mit dem Schlafnullierungsapparat zu schlafen und das Ausmaß des durch Entzug induzierten Rebound-Schlafes zu bestimmen.

Serie: The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Forschung

Neurowissenschaften

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Immunologie und Infektion

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Verhalten

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian clock modulates alcohol sensitivity, but not the formation of tolerance. Here, we describe our protocol in detail. Alcohol is administered to the flies using the FlyBar. In this setup, saturated alcohol vapor is mixed with humidified air in set proportions, and administered to the flies in four tubes simultaneously. Flies are reared under standardized conditions in order to minimize variation between the replicates. Three-day old flies of different genotypes or treatments are used for the experiments, preferably by matching flies of two different time points (e.g., CT 5 and CT 17) making direct comparisons possible. During the experiment, flies are exposed for 1 hr&#160;to the pre-determined percentage of alcohol vapor and the number of flies that exhibit the Loss of Righting reflex (LoRR) or sedation are counted every 5 min. The data can be analyzed using three different statistical approaches. The first is to determine the time at which 50% of the flies have lost their righting reflex and use an Analysis of the Variance (ANOVA) to determine whether significant differences exist between time points. The second is to determine the percentage flies that show LoRR after a specified number of minutes, followed by an ANOVA analysis. The last method is to analyze the whole times series using multivariate statistics. The protocol can also be used for non-circadian experiments or comparisons between genotypes.

Drosophila has emerged as a significant model system for dissecting the cellular and molecular underpinnings of behavioral responses to alcohol. Here we present a protocol for the collection of alcohol sensitivity data in a circadian context that can be easily applied to other experiments and is well-suited for undergraduate research.

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Hochdurchsatzmethode zur Messung der Alkoholsedationszeit einzelner Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

Ein einstellbares Hochauflösendes Bildgebungssystem für Verhaltensstudien von Drosophila Erwachsenen

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

Weiterentwicklung der Behandlung von Schlafstörungen: Ein Drosophila-basierter Screening-Ansatz

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

Autor im Rampenlicht: Überwindung von Herausforderungen bei der Schlafmessung von Drosophila mit dem DAM-System 

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Der Schlaf-Nullifizierungsapparat: Eine hocheffiziente Methode zur Schlafentzugs-Drosophila

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

Hochdurchsatzmethode zur Messung der Alkoholsedationszeit einzelner Drosophila melanogaster

Ein einstellbares Hochauflösendes Bildgebungssystem für Verhaltensstudien von Drosophila Erwachsenen

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster