עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH 5R01NS051305-14 ו 5R01NS076980-08 ל- PJS.

1. הכנה ניסיונית
<ol><li>לאסוף זבובים כשהם מתחלקים לתוך בקבוקונים, הפרדת זבובים זכר ונקבה. הערה: ניסויי שינה נערכים בדרך כלל עם זבובים נשיים. חשוב לאסוף נקבות בתולות. נקבות מויזות יטילו ביצים שבוקעות לתוך זחלים מה שמסבך את ניתוח הנתונים.</li>
	<li>זבובי בית של מין אחד בקבוצות של <20. הערה: דיור טס בסביבה מועשרת חברתית (קבוצות של >50) מווסתכונןשינה 6,13 מדידות מבלבלות פוטנציאליות של שינה ריבאונד. יתר על כן, לאחר העשרה חברתית, השינה תרד על פני כמה ימים6. לכן, שינה בסיסית אינה יציבה לסבך ניתוח של שינה ריבאונד. שמירה על זבובים בקבוצות של <20 מונעת את הבלבול הפוטנציאלי הזה.</li>
	<li>יש לשמור על זבובים בבקבוקונים למשך 3-5 ימים בסביבה מבוקרת אור ולחות. הערה: גיל ובגרות של זבובים משפיעים מאוד על השינה. השינה גבוהה בזבובים בני יום אחד ומתייצבת על ידי 3-5 ימים של גיל4. זבובים נשמרים בדרך כלל על אור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות ב-50% לחות.</li>
</ol>2. הכנת צינורות להקלטת שינה
הערה: השינה מנוטרת באמצעות צגי פעילות לוקומוטור. צג יכול להחזיק 32 זבובים שוכנים בנפרד בצינורות בקוטר 5 מ"מ. בדרך כלל, גנוטיפים מנותחים בקבוצות של 16 או 32 זבובים.
<ol><li>הכן מספר מתאים של צינורות עם מזון זבוב בקצה אחד. הערה: דיאטה ומטבוליזם ידועים להשפיע על שינה33,34, ולכן חשוב במיוחד למקם זבובים על אותו מזון שבו הם גדלו.</li>
	<li>לאטום את קצה הצינורות עם שעווה. הערה: מניעת שינה וריבאונד הם ניסוי של חמישה ימים, ומזון יכול להתייבש אם לא אטום כראוי. בצינורות אטומים כראוי, מזון יכול להישמר במשך 10 ימים או יותר. לכן, זה קריטי כדי להבטיח כי הקצוות של הצינורות אטומים היטב. זבובים יכולים גם להיתקע למזון רטוב, עם זאת. לכן, זה עוזר לעשות צינורות 1-2 ימים לפני תחילת הניסוי.</li>
	<li>במקום בנפרד להתעורר, מתנהג זבובים לתוך צינורות זכוכית באורך 65 מ"מ להקלטת שינה באמצעות שאיפה ולחבר את הקצה של הצינורות עם פקק קצף. הערה: זבובים לעולם אינם נחשפים מחדש להרדמה CO2 בעת הצבת זבובים לתוך צינורות להקלטת שינה. השאפתן עשוי צינורות גומי עם קצה אחד מכוסה גבינה מוכנס לתוך קצה פיפטה 1 מ"ל.</li>
</ol>3. הקלטת שינה
<ol><li>טען זבובים בצינורות לתוך צגי פעילות כדי לפקח על השינה. הערה: סלעי SNAP מנטרים הלוך ושוב מ - 60° ל + 60 ° כל ~ 10s. המסכים מוחזקים ב-60° עבור ~ 5.9s ; נדרשים ~2.9 s כדי שהמגש יחזיק את הצגים יעבור מ- -60° ל- +60° ו- ~ 1 s כדי לחזור מ- +60° ל- -60°. ניתן לשנות את אורך המחזור לפי הצורך על ידי התאמת המתח המסופק למנוע.<ol>
<li>הקפד להבטיח כי צינורות ממוקמים צגי פעילות בכיוון הנכון. בכיוון הנכון, קצה הצינור עם מזון נמצא בחלק העליון של SNAP כדי להבטיח כי זבובים לא לקבל דחף לתוך המזון. בנוסף, הסוף עם מזון הוא בצד של הצג עם שקע הקלטת השינה. הדבר מאפשר למוניטורים של הפעילות להיות מכוונים כראוי ב- SNAP למחסור יעיל בשינה ובו זמנית ניטור הפעילות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם צגי פעילות בתא ההקלטה כדי לפקח על השינה.</li>
	<li>נטר שינה במשך יומיים מלאים לפחות כדי להעריך שינה בסיסית. הערה: היום זבובים נטענים לתוך צגי פעילות בדרך כלל אינו נכלל כיום הסתגלות כדי לאפשר לזבובים להסתגל להיות מאוכסן בצינורות. שינה בסיסית נרשמת לפחות יומיים מלאים (48 שעות) החל מהבוקר שאחרי היום זבובים נטענים.</li>
	<li>שמור ספירת פעילות locomotor של זבובים בפחים של דקה אחת מרגע האורות ביום נתון לאורות ביום הקודם באמצעות תוכנת הקלטת פעילות (למשל, מ 8 בבוקר עד 8 בבוקר).</li>
	<li>הערכת שינה מנתוני הפעילות של locomotor באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית באמצעות 5 דקות של חוסר פעילות כסף עבור התקף שינה35. הערה: מספר מדדי שינה מחושבים מספירת הפעילות של locomotor. אלה כוללים שינה של דקה/שעה מעל 24 שעות, זמן שינה כולל ב 24 שעות, ממוצע ומקסימום בשעות היום ולילה אורכים36.</li>
</ol>4. מניעת שינה והתאוששות
<ol><li>כמו זבובים ניתן להעריך שינה במשך פרקי זמן משתנים (למשל, 12 שעות, 24 שעות ו 36 שעות) ואת השינה התאוששות ניתן גם להעריך במרווחי זמן שונים (למשל, 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות ו 48 שעות), לקבוע את משך ההחלמה על ידי צורך ניסיוני. ניתן לדמיין שחזור שינה באמצעות עלילת רווח/אובדן שינה או על ידי בחינת אחוז שינה התאושש על מרווח קבוע מראש (למשל, 6 שעות).</li>
	<li>אם השינה יציבה ביומיים הבסיסיים, ביום השלישי, מקם צגי פעילות לתוך SNAP למחסור בשינה למשך הלילה. הערה: זבובים יציגו ריבאונד שינה חזק על פני מגוון של שינה פעמים8,32,37,38, אבל השינה צריכה להיות יציבה כדי להעריך באופן אמין ריבאונד שינה. השינה יציבה כאשר ההבדל בשינה בין ימי הבסיס הוא ± 100 דקות.</li>
	<li>ודאו שמסכי הפעילות מאובטחים במקום עם סיכות מחזיקי צג, כבלי צג המחוברים לחשמל וצגים מכוונים נכון עם הסוף עם מזון מאחור, ומחסומי פלסטיק מלפנים(איור 1). הערה: ה-SNAP מתוכנן כך שהמצלמה מסתובבת אחת ל-10 s(איור 1). הכנסת הפלסטיק מאפסת את הצינורות על ידי דחיפת הצינורות בחזרה כאשר המנגנון נמצא במצב "למעלה". איפוס הצינורות חשוב כדי להבטיח כי כל הצינורות יש את טווח התנועה המלא בתחילת כל מחזור.</li>
	<li>נתק את צגי הפעילות והוציא את המסכים מה-SNAP מיד עם הדלקת האורות בעקבות מניעת שינה במהלך הלילה. הערה: זה קריטי כי מניעת שינה מסתיימת, וזבובים ממוקמים בהתאוששות מיד על אורות על בעקבות 12 שעות של מניעת שינה לילה. אפילו עיכוב של 20-30 דקות בהצבת זבובים בהתאוששות יכול להפריע להיקף השינה החוזרת.</li>
	<li>הנח זבובים בתא הקלטות שבו הם יהיו ללא הפרעה במשך יומיים (48 שעות) כדי לפקח על שנת ההתאוששות. הערה: אם תא ההקלטה משמש לניסויים אחרים, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע גירוי זבובים מחלימים.</li>
	<li>חשב את כמות השינה שאבדה. עבור כל זבוב בודד, לחשב את ההבדל השעתי בין שינה המתקבלת במהלך מניעת שינה לבין השעה המקבילה במהלך קו הבסיס; לסכם את ההבדלים לשעה כדי לחשב את השינה הכוללת שאבדה.</li>
	<li>חשב את כמות השינה ששוחזרה. עבור כל זבוב בודד, לחשב את ההבדל השעתי בין שינה המתקבלת במהלך ההתאוששות לבין השעה המתאימה במהלך קו הבסיס; לסכם את ההבדלים לשעה כדי לחשב את השינה הכוללת שנצבר. הערה: אם זבוב הוא למעשה חסר שינה הוא אמפירי. לכן, הנסיין צריך לבחון אחוז שינה אבודה. אם הזבוב לא איבד כמות מספקת של שינה זה יכול להיות נשלל מהניתוח. למרות שזה עשוי להידרש עבור גישות אחרות מניעת שינה, זה רק לעתים רחוקות אם אי פעם נדרש עבור SNAP. בדרך כלל יותר, שינה לא יכול להיות יציב זבוב נתון לפני החניכה של מניעת שינה. אם השינה אינה יציבה, לא ניתן לחשב הומאוסטזיס. אנו מקבלים הבדל מרבי של ± 100 דקות שינה המחושב לפני תחילת מניעת השינה כמועמדים להכללה. לעיתים, שנתו של זבוב בודד מחולקת באופן לא אחיד על פני 24 שעות ביממה (למשל, אנשים מסוימים עשויים לקבל 60-70% ממכסת השינה שלהם במהלך היום ובכך לאבד רק חלק קטן ממכסת השינה שלהם 24 שעות כאשר נמנע מהם 12 שעות בלילה). זבובים אלה ניתן להעריך בנפרד.</li>
	<li>חשב את האחוז הממוצע של שינה התאוששה (יחסית לקו הבסיס) מעל 12 שעות, 24 שעות ו 48 שעות של תקופת ההתאוששות עבור כל גנוטיפ.</li>
	<li>מנתוני שינה, חשב את אורך השינה הממוצע והמקסימלי בשעות היום בקו הבסיס, ואת ימי ההתאוששות עבור כל גנוטיפ. הערה: שינה ריבאונד בזבובים מאופיינת בכמות שינה מוגברת, ועומק שינה מוגבר בימי ההתאוששות. איחוד שינה משמש כמדד של עומק שינה. סף עוררות יכול לשמש גם כמדד של עומק שינה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nath, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Jellyfish+Cassiopea+Exhibits+a+Sleep-like+State.">The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State.</a> Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).</li><li>Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sleep+in+Aplysia+californica.">Characterization of sleep in Aplysia californica.</a> Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).</li><li>Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+promotes+sleep-like+state+in+zebrafish.">Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish.</a> Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).</li><li>Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waking+experience+affects+sleep+need+in+Drosophila.">Waking experience affects sleep need in Drosophila.</a> Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+receptor+activation+in+the+mushroom+bodies+rescues+sleep-loss-induced+learning+impairments+in+Drosophila.">D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila.</a> Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).</li><li>Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+sleep+by+remote+control+facilitates+memory+consolidation+in+Drosophila.">Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).</li><li>Seidner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Neurons+with+a+Privileged+Role+in+Sleep+Homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).</li><li>Li, X., Yu, F., Guo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+specifically+impairs+short-term+olfactory+memory+in+Drosophila.">Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila.</a> Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).</li><li>Melnattur, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+sleep+in+supporting+Spatial+Learning+in+Drosophila.">A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila.</a> Sleep. , 197 (2020).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+during+early-adult+development+results+in+long-lasting+learning+deficits+in+adult+Drosophila.">Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila.</a> Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).</li><li>Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use-dependent+plasticity+in+clock+neurons+regulates+sleep+need+in+Drosophila.">Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 105-108 (2009).</li><li>Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+synaptic+homeostasis:+structural+evidence+in+Drosophila.">Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila.</a> Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).</li><li>Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., G&#246;tz, T., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Active+Zone+Plasticity+Encodes+Sleep+Need+in+Drosophila.">Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila.</a> Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).</li><li>Kirszenblat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+regulates+visual+selective+attention+in+Drosophila.">Sleep regulates visual selective attention in Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Singh, P., Donlea, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Regulation+of+Sleep+and+Synapse+Pruning+after+Neural+Injury.">Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury.</a> Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).</li><li>Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Regulates+Glial+Plasticity+and+Expression+of+the+Engulfment+Receptor+Draper+Following+Neural+Injury.">Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury.</a> Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).</li><li>Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+of+sleep+for+development+of+courtship+circuitry+and+behavior+in+Drosophila.">A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila.</a> Science. 344 (6181), 269-274 (2014).</li><li>Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+deprivation+suppresses+aggression+in+Drosophila.">Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila.</a> Elife. 4, 07643 (2015).</li><li>Szuperak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sleep+state+in+Drosophila+larvae+required+for+neural+stem+cell+proliferation.">A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Vaccaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Loss+Can+Cause+Death+through+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Gut.">Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut.</a> Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).</li><li>Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potassium+channel+&#946;-subunit+couples+mitochondrial+electron+transport+to+sleep.">A potassium channel &#946;-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep.</a> Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).</li><li>Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+machinery+of+sleep+homeostasis+in+Drosophila.">Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).</li><li>Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+Drive+Is+Encoded+by+Neural+Plastic+Changes+in+a+Dedicated+Circuit.">Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit.</a> Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).</li><li>Pimentel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operation+of+a+homeostatic+sleep+switch.">Operation of a homeostatic sleep switch.</a> Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).</li><li>Sitaraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Homeostatic+Sleep+Signals+by+Segregated+Synaptic+Microcircuits+of+the+Drosophila+Mushroom+Body.">Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body.</a> Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).</li><li>Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+and+ERK+by+rhomboid+signaling+regulates+the+consolidation+and+maintenance+of+sleep+in+Drosophila.">Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+modulates+sleep+homeostasis+and+learning+after+sleep+deprivation+in+Drosophila.">Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila.</a> Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).</li><li>Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+short-term+memory+defects+following+sleep+deprivation+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease.">Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).</li><li>Tabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+interacts+with+a&#946;+to+modulate+intrinsic+neuronal+excitability.">Sleep interacts with a&#946; to modulate intrinsic neuronal excitability.</a> Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).</li><li>Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+flight+increases+sleep+and+identifies+a+novel+sleep-promoting+pathway+in+Drosophila.">Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila.</a> Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).</li><li>Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perilipin+homologue,+lipid+storage+droplet+2,+regulates+sleep+homeostasis+and+prevents+learning+impairments+following+sleep+loss.">The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss.</a> PLOS Biology. 8 (8), (2010).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+and+cycle+limit+starvation-induced+sleep+loss+in+Drosophila.">Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).</li><li>Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+genes+protect+against+lethal+effects+of+sleep+deprivation+in+Drosophila.">Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila.</a> Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).</li><li>Andretic, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila:+moving+beyond+sleep+time.">Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li><li>Seugnet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+sleep+regulatory+genes+using+a+Drosophila+model+of+insomnia.">Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia.</a> Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).</li><li>Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Hyperkinetic+mutants+have+reduced+sleep+and+impaired+memory.">Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory.</a> Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).</li><li>Geissmann, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethoscopes:+An+open+platform+for+high-throughput+ethomics.">Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics.</a> PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שינה בדרוסופילים אופיינה באופן עצמאי בשנת 2000, על ידי שתי קבוצות4,5. במחקרים חלוציים אלה, זבובים נשללו שינה על ידי טיפול עדין (כלומר, מניעת ידיים) והוכחו להפגין תגובה הומיאוסטטית חזקה למחסור בשינה בלילה. חשוב לציין, עם כל ניסוי מניעת שינה זה חיוני כדי לשלו?...

השינה קרובה לאוניברסלית בבעלי חיים, אך תפקידה עדיין לא ברור. שינה הומאוסטזיס, עלייה מפצה בשינה בעקבות מניעת שינה, הוא מאפיין מגדיר של שינה, ששימש לאפיון מצבי שינה במספר בעלי חיים1,2,3,4,5.
לישון בזבוב יש קווי דמיון רבים עם שינה אנושית, כולל תגובה הומיאוסטטית חזקה לאובדן שינה4,5. מחקרים רבים של שינה בזבוב השתמשו במחסור בשינה הן כדי להסיק את תפקוד השינה על ידי בחינת ההשלכות השליליות המצטברות מהתעוררות ממושכת, והן כדי להבין את ויסות השינה על ידי קביעת המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים בוויסות ההומיאוסטטי של השינה. לכן זבובים מחוסרי שינה הוצגו להפגין ליקויים בלמידה ובזיכרון6,7,8,9,10,11,12, פלסטיות מבנית13,14,15, תשומת לב חזותית16, התאוששות מפגיעה עצבית17,18, הזדווגות והתנהגויות אגרסיביות19, 20, התפשטות תאים21, ותגובות ללחץ חמצוני22,23 אם להזכיר כמה. יתר על כן, חקירות של המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים על שינה ריבאונד הניבו תובנות קריטיות על המכונות העצביות המהוות את הומיאוסטטייק השינה8,9,23,24,25,26,27,28,29 . לבסוף, בנוסף לחשיפת תובנות בסיסיות על תפקוד השינה בבעלי חיים בריאים, מחקרים על מניעת שינה גם הודיעו תובנות על תפקוד השינה במצביםחולים 30,31.
בעוד מניעת שינה היא ללא ספק כלי רב עוצמה, עם כל ניסוי מניעת שינה, חשוב להבחין פנוטיפים הנובעים התעוררות ממושכת, מאלה המושרה על ידי הגירוי המשמש כדי לשמור על החיה ערה. מניעת שינה על ידי מניעת ידיים או טיפול עדין, נחשב בדרך כלל כקביעת התקן למחסור מינימלי בשינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה זבובים באמצעות מנגנון ביטול השינה (SNAP). ה-SNAP הוא מכשיר המספק גירוי מכני לטסים כל 10s, ושומר על זבובים ערים על ידי גרימת גיאוטקסיס שלילי(איור 1). ה-SNAP מונעת ביעילות זבובים >98% משנת הלילה, אפילו בזבובים עם הנעה בשינה גבוהה8,32. ה-SNAP מכויל על זבובים רגישים למפץ, תסיסה של זבובים ב-SNAP לא פוגעת בזבובים; מניעת שינה עם SNAP מעורר ריבאונד דומה לזה המתקבל על ידי מניעת יד7. ה- SNAP הוא אפוא שיטה חזקה למניעת זבובים בשינה תוך שליטה על ההשפעות של הגירוי המעורר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Locomotor activity tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Tissue Prep Wax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13404-122</td>
			<td>Wax used for sealing tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>Wale Apparatus</td>
			<td>244050</td>
			<td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&#160;tubes into 65mm long tubes&#160;to record sleep. Pre-cut tubes&#160;can also be purchased.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-113</td>
			<td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary glass cutting tool</td>
			<td>Dremel Multi Pro</td>
			<td>395</td>
			<td>Used to cut 65mm long glass tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring Sleep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM System and DAMFileScan software</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td></td>
			<td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition computer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>Idea Centre AIO3</td>
			<td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Activity Monitors</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>DAM2</td>
			<td>These monitors are used to record flies&#39; locomotor activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environment Monitor</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>DEnM</td>
			<td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Controller</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>LC4</td>
			<td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply Interface Unit for DAM</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>PSIU-9</td>
			<td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RJ11 connector</td>
			<td>7001-64PC</td>
			<td>Multicomp</td>
			<td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splitters</td>
			<td>Trikinetics</td>
			<td>SPLT5</td>
			<td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telephone cable wire</td>
			<td>Radioshack</td>
			<td>278-367</td>
			<td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleep Deprivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Gw INSTEK</td>
			<td>GPS-30300</td>
			<td>Power supply for the SNAP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sleep Nullifying Apparatus</td>
			<td>Washington University School of Medicine machine shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

הומאוסטזיס שינה, העלייה בשינה שנצפתה לאחר אובדן שינה, הוא אחד הקריטריונים המגדירים המשמשים לזיהוי שינה ברחבי ממלכת החיות. כתוצאה מכך, מניעת שינה והגבלת שינה הם כלים רבי עוצמה המשמשים בדרך כלל כדי לספק תובנה על תפקוד השינה. עם זאת, ניסויים מניעת שינה הם בעייתיים מטבעם בכך גירוי המחסור עצמו עשוי להיות הגורם לשינויים שנצפו בפיזיולוגיה ובהתנהגות. בהתאם לכך, טכניקות מוצלחות של מניעת שינה צריכות לשמור על בעלי חיים ערים, ובאופן אידיאלי, לגרום לריבויישן שינה חזק מבלי לגרום גם למספר רב של השלכות לא מכוונות. כאן, אנו מתארים טכניקה של מניעת שינה עבור Drosophila melanogaster. מנגנון ביטול השינה (SNAP) מנהל גירוי כל 10s כדי לגרום לגיאוטקסיס שלילי. למרות הגירוי צפוי, SNAP מונע ביעילות >95% של שינה בלילה אפילו זבובים עם כונן שינה גבוהה. חשוב לציין, התגובה ההומיאוסטטית הבאה דומה מאוד לזו שהושגה באמצעות מניעת ידיים. התזמון והמרווח של הגירויים ניתן לשנות כדי למזער את אובדן השינה ובכך לבחון השפעות לא ספציפיות של הגירוי על פיזיולוגיה והתנהגות. ה- SNAP יכול לשמש גם להגבלת שינה ולהעריך את סף העוררות. ה- SNAP היא טכניקה רבת עוצמה להפרעות שינה שניתן להשתמש בה כדי להבין טוב יותר את תפקוד השינה.

קנטון S (Cs) שימש כזן פראי. הזבובים נשמרו באור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות, ושינה נמנעה במשך 12 שעות בלילה. בדיקת פרופילי השינה של זבובי Cs ביום הבסיס (bs), יום מניעת שינה (sd) ושני ימי התאוששות (rec1 ו rec2) (איור 2A) עולה כי זבובים היו למעשה מניעת שינה SNAP, ושינה התאו...

Watch this Scientific Journal Video about The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila at JoVE.com

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

מניעת שינה היא כלי רב עוצמה לחקור את תפקוד השינה ואת הרגולציה. אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה Drosophila באמצעות מנגנון ביטול שינה, ולקבוע את היקף השינה ריבאונד הנגרמת על ידי מחסור.

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

the-sleep-nullifying-apparatus-highly-efficient-method-sleep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.3K Views.  Washington University School of Medicine. מניעת שינה היא כלי רב עוצמה לחקור את תפקוד השינה ואת הרגולציה. אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה Drosophila באמצעות מנגנון ביטול שינה, ולקבוע את היקף השינה ריבאונד הנגרמת על ידי מחסור.

Video: The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

שיטה של ​​הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

How to Obtain Reliable Visual Event-related Potentials in Newborns

The present study discusses the characteristics of visual event-related potentials (VEPs) and outlines methodological steps for obtaining reliable measurements in newborns. Obtaining high-quality, reliable VEPs is crucial for the early detection of abnormal development of the central nervous system in at-risk newborns, and for implementing successful early interventions. Recommendations are based on a previous study which showed that when post-conceptional age, polysomnography-identified sleep stages, and light-emitting diodes (LEDs) googles as the luminous source are controlled, no more than 4 repetitions of VEP averages are required to obtain replicable recordings, variability decreases, and reliable VEPs can be obtained. By controlling for these sources of variability and using statistical analyses, we were able to clearly and reliably identify the amplitude and latency of three main components (NII, PII and NIII) present in 100% of newborns (n = 20) during active sleep. Recording VEPs during awake states, quiet sleep and transitional sleep is not recommended because VEP morphology may differ significantly from one average to the next, leading to the risk of misleading clinical prognoses. Moreover, it is easier to obtain VEPs during active sleep because this state can be clearly and reliably identified at this stage of development, sleep cycles are short enough to allow measurements to be taken in a reasonable time, and the method does not require new o expensive equipment.

Several important points for obtaining high-quality reliable visual evoked potentials (VEPs) in newborns while minimizing variability and the risk of misleading prognoses are presented.

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

שיטה של הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב

נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

כיצד להשיג אמין חזותי אירועים הקשורים פוטנציאל תינוקות

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

שיטה של ​​הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב

נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

כיצד להשיג אמין חזותי אירועים הקשורים פוטנציאל תינוקות

שיטה של הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש