توفر هذه الطريقة حلولا للأسئلة البيولوجية الصعبة اليوم. من تجربة FPOP في الخلية ، يمكننا دراسة التفاعلات بين البروتين والليغاند ، ومواقع التفاعل بين البروتين والبروتين ، ومناطق التغيير التوافقي. ميزة هذه التكنولوجيا هي استخدام منصة IC-FPOP الآلية المستندة إلى ستة آبار والتي تجعل من الممكن زراعة الخلايا وإجراء دراسات FPOP داخل الخلية مباشرة في الليزر.
ويمكن استخدام هذه الطريقة في الصناعات الصيدلانية والتكنولوجيا الحيوية، فضلا عن معاهد البحوث الأكاديمية والسريرية الكبرى، وخاصة من قبل المحققين البيولوجيين في الجامعات التي تدرس ديناميات البروتين. للبدء، فك حاضنة المنصة من مرحلة تحديد المواقع وفصل خطوط درجة الحرارة والغاز ومرطب. رش الحاضنة مع 70٪ الإيثانول ووضعه في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
قم بإزالة اللوحة ذات الست آبار من حاضنة المنصة، وتأمين الغطاء الأصلي للوح، وتأكيد التقاء الخلايا باستخدام المجهر، ثم ضع لوحة الستة آبار مع خلايا التقاء مرة أخرى في حاضنة المنصة داخل غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية. أدخل ثلاثة أنابيب تايغون مسبقة القطع في كل بئر عبر المنافذ المضمنة عن طريق مسح الأنابيب إلى جدران البئر وتأمينها بحلقات مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة. إعداد برنامج تكامل البرنامج النصي لسحب المضخة.
استخدام مضخة واحدة التجذم لإزالة وسائط الخلية تماما من جميع الآبار الستة. المذيبات الرئيسية في كل قناة من المضخات التجاوية الثلاث الأخرى ، ثم غرس بيروكسيد الهيدروجين وحاجز Quench في أنابيب بالتناوب الخاصة بهم حتى تصل الكواشف إلى منافذ الحاضنة. تأكد من أن شعاع الليزر قد تم زاوية بشكل صحيح ويصل إلى الحاضنة دون عائق.
تحقق من طاقة الليزر باستخدام مستشعر خارجي. إعداد البرنامج النصي تكامل ضخ مضخة بعد تأكيد محاذاة الحزمة. غرس 200 ملليمولار بيروكسيد الهيدروجين في 35 ملليلتر في الدقيقة الواحدة في البئر الأول.
اضغط على زر البدء على برنامج الليزر عند علامة الخمس ثوان لتشغيل النبض عند علامة ال 11 ثانية على جهاز ضبط الوقت. غرس محلول 125 ملليمولار Quench بمعدل 35 ملليلتر في الدقيقة في البئر الأول مباشرة بعد نبض الليزر. يدويا نقل مرحلة تحديد المواقع لمحاذاة البئر المقبل مع شعاع الليزر وتكرار العملية لجميع الآبار.
في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، استخدم مكشطة الخلية لنقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. خلايا الطرد المركزي في 1، 200 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة تحلل RIPA.
نقل الخلايا إلى أنابيب البولي بروبلين 1.2 ملليلتر الفردية. فلاش تجميد جميع العينات في النيتروجين السائل ووضعها في الفريزر ناقص 80 درجة حتى الاستخدام. لترجمة تعديلات FPOP، قم بتحليل تحلل الخلية المهضومة باستخدام تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي الكروماتوغرافي السائل، ثم احسب مدى التعديل.
وللتأكد من أن ظروف حاضنة المنصة كافية لزراعة الخلايا في منصة الليزر، تم تحويل GCaMP2 بشكل عابر إلى HEK293T وتم تقييم كفاءة العدوى لكلا اللوحين عن طريق التصوير الفلوري. وقد أجريت عملية فحص لوسيفيراز لكمية كفاءة العدوى. تمت مقارنة تعديلات FPOP في خلايا HEK293T المسماة في نظام التدفق بتلك المسماة في حاضنة المنصة.
وتفوقت حاضنة المنصة على نظام التدفق سواء في عدد البروتينات المعدلة أو في إجمالي تغطية FPOP في تلك البروتينات. وفي نظام التدفق، تم الكشف عن ببتيدات معدلة، مما يوفر معلومات هيكلية محدودة. ومع ذلك ، تم الكشف عن خمسة الببتيدات المعدلة التي تمتد على تسلسل actin في حاضنة المنصة.
جنبا إلى جنب أطياف MS من أكتين مع برولين المعدلة في كل من النظم والببتيد actin غير المعدلة تظهر هنا. وتحتوي المخلفات المعدلة ل FPOP في عينات حاضنة المنصة على 12 بقايا معدلة، وثلاثة مخلفات معدلة في نظام التدفق، وبقايا معدلة متداخلة واحدة. وكشف تحليل LC-MS MS أن 792 بروتينا تم تعديلها في الجسم الحي FPOP في حاضنة المنصة مقارنة بالبروتينات ال 545 المعدلة مع نظام التدفق.
من الضروري إبقاء الخلايا تحت ظروف معقمة. أحضر دائما حاضنة المنصة إلى غطاء محرك السيارة العقيم لثقافة الخلايا لإدخال جميع اللوحات والأنابيب والحلقات الضرورية ذات الست آبار. وهذا يضمن سلامة التجربة.
