この方法は、今日の厳しい生物学的な質問のためのソリューションを提供します。細胞内FPOP実験から、タンパクリガンド相互作用、タンパク質相互作用部位、および立体構造変化の領域を研究することができます。この技術の利点は、細胞を成長させ、レーザーで細胞内FPOP研究を行うことを可能にする自動化された6ウェルプレートベースのIC-FPOPプラットフォームの使用です。
この方法は、製薬およびバイオテクノロジー産業、特にタンパク質ダイナミクスを研究する大学の生物学的研究者によって、主要な学術および臨床研究機関で使用することができます。まず、プラットフォームインキュベーターを位置決め段階から外し、温度、ガス、加湿器ラインを取り外します。70%エタノールでインキュベーターをスプレーし、細胞培養フードに入れます。
プラットフォームインキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、プレートの元の蓋を固定し、顕微鏡を使用して細胞の合流を確認し、コンフルエント細胞を持つ6ウェルプレートを細胞培養フード内のプラットフォームインキュベーターに戻します。ウェルの壁にチューブをフラッシュすることにより、埋め込みポートを介して各ウェルに3つのプリカットタイゴンチューブを挿入し、カスタム3Dプリントリングでそれらを確保します。ポンプ撤退のための統合ソフトウェアスクリプトを準備します。
1つの蠕動ポンプを使用して、6つのウェルすべてから細胞培地を完全に除去します。他の3つの蠕動ポンプの各チャネルに溶媒を主に、次に、試薬がインキュベーターポートに到達するまで、それぞれの交番チューブに過酸化水素とクエンチバッファーを注入する。レーザービームが正しく傾いており、インキュベーターに無制限に到達していることを確認します。
外部センサーを使用してレーザーエネルギーをチェックします。ビームの位置合わせを確認した後、ポンプ注入用の統合ソフトウェアスクリプトを準備します。1分あたり35ミリリットルで200ミリモル過酸化水素を最初の井戸に注入する。
5秒のマークでレーザーソフトウェアのスタートボタンを押して、タイマーの11秒のマークでパルスをトリガーします。レーザーパルスの直後に1分あたり35ミリリットルで125ミリモルクエンチ溶液を注入します。手動でレーザービームと次の井戸を整列し、すべての井戸のためのプロセスを繰り返すために位置決め段階を移動します。
細胞培養フードでは、細胞スクレーパーを使用して、各ウェルから個々の15ミリリットルの円錐管に細胞を移す。遠心分離細胞は1,200倍Gで5分間行う。上清を捨て、100マイクロリットルのRIPAライシスバッファーで細胞を再懸濁します。
細胞を個々の1.2ミリリットルのポリプロピレンチューブに移す。フラッシュは液体窒素ですべてのサンプルを凍結し、使用するまでマイナス80度の冷凍庫に入れます。FPOP修飾を局所化するには、液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いて消化細胞溶解物を分析し、次に修飾の程度を計算する。
プラットフォームインキュベーター条件がレーザープラットフォームでの細胞培養に十分であることを確認するために、GCaMP2はHEK293Tに一過性トランスフェクションされ、両方のプレートのトランスフェクション効率を蛍光イメージングで評価した。トランスフェクション効率を定量化するためにルシファーゼアッセイを行った。フローシステムで標識されたHEK293T細胞におけるFPOP改変を、プラットフォームインキュベーターで標識したものと比較した。
プラットフォームインキュベーターは、改変されたタンパク質の数とそれらのタンパク質の合計FPOPカバレッジの両方でフローシステムを上回りました。フローシステムでは、2つの修飾ペプチドが検出され、限られた構造情報を提供した。しかし、アクチン配列にまたがる5個の改変ペプチドがプラットフォームインキュベーターで検出された。
タンデムMSスペクトルのアクチンと、両方の系におけるプロリンと非修飾アクチンペプチドの両方を用いて示す。プラットフォームインキュベーターサンプル中のFPOP改変残基には、12個の改変残基、フローシステム内の3つの改変残基、および1つの重複する改変残基が含まれていた。LC-MS MS分析の結果、792のタンパク質が、フローシステムで改変された545タンパク質と比較して、プラットフォームインキュベーターでin vivo FPOPによって改変されたことが明らかになった。
細胞を無菌状態に保つことが不可欠です。常に滅菌細胞培養フードにプラットフォームインキュベーターを持って来て、必要なすべての6ウェルプレート、チューブ、リングを挿入します。これにより、実験の完全性が保証されます。
