Bu yöntem, günümüzün zorlu biyolojik soruları için çözümler sunar. Hücre içi bir FPOP deneyinden protein-ligand etkileşimlerini, protein-protein etkileşim alanlarını ve konformasyonsal değişim bölgelerini inceleyebiliriz. Bu teknolojinin avantajı, hücreleri büyütmeyi ve hücre içi FPOP çalışmalarını lazerde gerçekleştirmeyi mümkün kılan otomatik altı kuyulu plaka tabanlı bir IC-FPOP platformunun kullanılmasıdır.
Bu yöntem, ilaç ve biyoteknoloji endüstrilerinin yanı sıra büyük akademik ve klinik araştırma enstitülerinde, özellikle protein dinamiklerini inceleyen üniversitelerdeki biyolojik araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Başlamak için, platform inkübatörunu konumlandırma aşamasından sökün ve sıcaklık, gaz ve nemlendirici hatlarını çıkarın. İnkübatöre% 70 etanol püskürtün ve hücre kültürü başlığına yerleştirin.
Altı kuyulu plakayı platform inkübatöründen çıkarın, plakanın orijinal kapağını sabitleyin ve bir mikroskop kullanarak hücre konfluensini onaylayın, ardından altı kuyulu plakayı birleştiği hücrelerle hücre kültürü kaputunun içindeki platform inkübatörüne geri yerleştirin. Tüpleri kuyu duvarlarına boşaltarak gömülü bağlantı noktaları aracılığıyla her kuyuya önceden kesilmiş üç Tygon tüpü yerleştirin ve bunları özel 3D baskılı halkalarla sabitleyin. Pompa çekilmesi için bir entegrasyon yazılımı komut dosyası hazırlayın.
Altı kuyudan da hücre medyasını tamamen çıkarmak için bir peristaltik pompa kullanın. Diğer üç peristaltik pompanın her kanalındaki prime çözücüler, daha sonra reaktifler inkübatör bağlantı noktalarına ulaşana kadar ilgili alternatif tüplerinde hidrojen peroksit ve söndürme tamponu demleyin. Lazer ışının doğru açılı olduğunu ve inkübatöre sınırsız olarak ulaştığını onaylayın.
Harici bir sensör kullanarak lazer enerjisini kontrol edin. Işın hizalamasını onayladıktan sonra pompa infüzyonu için entegrasyon yazılımı komut dosyasını hazırlayın. İlk kuyuya dakikada 35 mililitrede 200 milimoler hidrojen peroksit demleyin.
Zamanlayıcıdaki 11 saniyelik işarette darbeyi tetiklemek için lazer yazılımındaki beş saniyelik işaretteki başlat düğmesine basın. Lazer darbeden hemen sonra ilk kuyuya dakikada 35 mililitrede 125 milimolar söndürme solüsyonu demleyin. Bir sonraki kuyuyu lazer ışını ile hizalamak için konumlandırma aşamasını manuel olarak hareket ettirilin ve tüm kuyular için işlemi tekrarlayın.
Bir hücre kültürü başlığında, hücreleri her kuyudan ayrı ayrı 15 mililitre konik tüplere aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri beş dakika boyunca 1,200 kez G'de santrifüjleyin. Üstnatantı atın ve hücreleri 100 mikrolitre RIPA liziz tamponunda yeniden biriktirin.
Hücreleri tek tek 1,2 mililitre polipropilen tüplere aktarın. Tüm numuneleri sıvı nitrojende flaşla dondurun ve kullanıma kadar eksi 80 derecelik bir dondurucuya yerleştirin. FPOP modifikasyonlarını lokalize etmek için, sindirilen hücre lisatı sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi analizi kullanarak analiz edin, ardından modifikasyonun kapsamını hesaplayın.
Platform inkübatör koşullarının lazer platformundaki hücre kültürü için yeterli olduğunu doğrulamak için, GCaMP2 geçici olarak HEK293T'ye transkseptif olarak transkripsiyon edildi ve her iki plaka için transfeksiyon verimliliği floresan görüntüleme ile değerlendirildi. Transeksiyon verimliliğini nicelleştirmek için bir luciferaz tahlili yapıldı. Akış sisteminde etiketlenen HEK293T hücrelerindeki FPOP modifikasyonları, platform inkübatörde etiketlenenlerle karşılaştırıldı.
Platform inkübatörü, hem modifiye protein sayısında hem de bu proteinlerdeki toplam FPOP kapsama alanında akış sistemini geride bıraktı. Akış sisteminde, sınırlı yapısal bilgi sağlayan iki modifiye peptit tespit edildi. Bununla birlikte, platform inkübatörde aktin dizisini kapsayan beş modifiye peptit tespit edildi.
Her iki sistemde de modifiye proline ve değiştirilmemiş aktin peptit ile actin tandem MS spektrumu burada gösterilmiştir. Platform inkübatör örneklerindeki FPOP modifiye kalıntılar 12 modifiye kalıntı, akış sisteminde üç modifiye kalıntı ve bir üst üste binen modifiye kalıntı içeriyordu. LC-MS MS analizi, platform inkübatöründe in vivo FPOP tarafından akış sistemi ile değiştirilen 545 proteine kıyasla 792 proteinin modifiye edildiğini ortaya koydu.
Hücreleri steril koşullarda tutmak zorunludur. Gerekli tüm altı kuyu plakalarını, boruları ve halkaları yerleştirmek için platform inkübatörünü her zaman steril hücre kültürü başlığına getirin. Bu, deneyin bütünlüğünü sağlar.
