Este método proporciona soluciones para las exigentes cuestiones biológicas actuales. A partir de un experimento FPOP en células, podemos estudiar interacciones proteína-ligando, sitios de interacción proteína-proteína y regiones de cambio de conformación. La ventaja de esta tecnología es el uso de una plataforma automatizada ic-fpop basada en placas de seis pozos que permite cultivar células y realizar estudios FPOP en la célula directamente en el láser.
Este método se puede utilizar en industrias farmacéuticas y biotecnológicas, así como en importantes institutos de investigación académica y clínica, especialmente por investigadores biológicos en universidades que estudian dinámicas proteicas. Para empezar, desenrosque la incubadora de plataforma de la etapa de posicionamiento y desconecte las líneas de temperatura, gas y humidificador. Rocíe la incubadora con un 70% de etanol y colóquela en la campana del cultivo celular.
Retire la placa de seis pozos de la incubadora de plataforma, asegure la tapa original de la placa y confirme la confluencia celular usando un microscopio, luego coloque la placa de seis pozos con células confluentes en la incubadora de plataforma dentro de la campana de cultivo celular. Inserte tres tubos Tygon precortados en cada pozo a través de los puertos incrustados tirando los tubos a las paredes del pozo y asegurándolos con anillos impresos 3D personalizados. Prepare un script de software de integración para la retirada de la bomba.
Utilice una bomba peristáltica para eliminar completamente los medios celulares de los seis pozos. Los disolventes primos en cada canal de las otras tres bombas peristálticas, luego infunden peróxido de hidrógeno y amortiguador de enfriamiento en sus respectivos tubos alternos hasta que los reactivos lleguen a los puertos de incubadora. Confirme que el rayo láser se ha inclinado correctamente y llega a la incubadora desinhibido.
Compruebe la energía láser utilizando un sensor externo. Prepare el script de software de integración para la perfusión de la bomba después de confirmar la alineación del haz. Infunda 200 mililitros de peróxido de hidrógeno a 35 mililitros por minuto en el primer pozo.
Pulse el botón de inicio del software láser en la marca de cinco segundos para activar el pulso a la marca de 11 segundos en el temporizador. Infunda 125 mililitros solución de enfriamiento a 35 mililitros por minuto en el primer pozo inmediatamente después del pulso láser. Mueva manualmente la etapa de posicionamiento para alinear el siguiente pozo con el rayo láser y repita el proceso de todos los pozos.
En una campana de cultivo celular, utilice un raspador de células para transferir las células de cada pozo a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Células centrífugas a 1.200 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a abrir las células en 100 microlitros del búfer de lisis RIPA.
Transfiera las células a tubos individuales de polipropileno de 1,2 mililitros. Flash congelar todas las muestras en nitrógeno líquido y colocarlas en un congelador de menos 80 grados hasta su uso. Para localizar las modificaciones de FPOP, analice el lisato de celda digerido mediante el análisis de espectrometría de masa tándem cromatografía líquida y, a continuación, calcule el grado de modificación.
Para confirmar que las condiciones de la incubadora de plataformas son suficientes para el cultivo celular en la plataforma láser, GCaMP2 se transfectó transitoriamente a HEK293T y la eficiencia de transfección para ambas placas se evaluó a través de imágenes de fluorescencia. Se realizó un ensayo luciferasa para cuantificar la eficiencia de la transfección. Las modificaciones FPOP en las celdas HEK293T etiquetadas en el sistema de flujo se compararon con las etiquetadas en la incubadora de plataforma.
La incubadora de plataformas superó al sistema de flujo tanto en el número de proteínas modificadas como en la cobertura total de FPOP en esas proteínas. En el sistema de flujo, se detectaron dos péptidos modificados, proporcionando información estructural limitada. Sin embargo, se detectaron cinco péptidos modificados que abarcaban la secuencia actin en la incubadora de plataforma.
Aquí se muestran espectros de EM tándem de actina con prolina modificada en ambos sistemas y péptido de actina no modificado. Los residuos modificados FPOP en las muestras de incubadora de plataforma contenían 12 residuos modificados, tres residuos modificados en el sistema de flujo y uno sobrepuesto de residuos modificados. El análisis de LC-MS MS reveló que 792 proteínas fueron modificadas por FPOP in vivo en la incubadora de plataformas en comparación con las 545 proteínas modificadas con el sistema de flujo.
Es imperativo mantener las células en condiciones estériles. Lleve siempre la incubadora de plataforma a la campana de cultivo celular estéril para insertar todas las placas, tubos y anillos de seis pozos necesarios. Esto garantiza la integridad del experimento.
