Diese Methode bietet Lösungen für die anspruchsvollen biologischen Fragen von heute. Aus einem in-Zell-FPOP-Experiment können wir Protein-Ligand-Wechselwirkungen, Protein-Protein-Interaktionsstellen und Regionen der Konformationsveränderung untersuchen. Der Vorteil dieser Technologie ist der Einsatz einer automatisierten, auf sechs Bohrgut basierenden IC-FPOP-Plattform, die es ermöglicht, Zellen zu züchten und in-Zell-FPOP-Studien direkt am Laser durchzuführen.
Diese Methode kann in der Pharma- und Biotech-Industrie sowie in großen akademischen und klinischen Forschungsinstituten eingesetzt werden, insbesondere von biologischen Forschern an Universitäten, die proteindynamische untersuchen. Lösen Sie zunächst den Plattform-Inkubator von der Positionierphase und trennen Sie die Temperatur-, Gas- und Luftbefeuchterleitungen. Sprühen Sie den Inkubator mit 70% Ethanol und legen Sie ihn in die Zellkulturhaube.
Entfernen Sie die Sechs-Well-Platte aus dem Plattform-Inkubator, sichern Sie den ursprünglichen Deckel der Platte und bestätigen Sie die Zellkonfluenkation mit einem Mikroskop, und legen Sie die Sechs-Well-Platte mit konfluenten Zellen dann wieder in den Plattform-Inkubator innerhalb der Zellkulturhaube. Legen Sie drei vorgeschnittene Tygon-Rohre in jedem Brunnen über die eingebetteten Anschlüsse ein, indem Sie die Rohre an die Brunnenwände spülen und mit kundenspezifischen 3D-gedruckten Ringen sichern. Bereiten Sie ein Integrationssoftwareskript für die Pumpenentnahme vor.
Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um Zellmedien vollständig aus allen sechs Brunnen zu entfernen. Prime Lösungsmittel in jedem Kanal der anderen drei peristaltischen Pumpen, dann wasserstoffperoxid und Quench Puffer in ihren jeweiligen Wechselschläuchen infundieren, bis die Reagenzien die Inkubator-Ports erreichen. Bestätigen Sie, dass der Laserstrahl korrekt abgewinkelt wurde und den Inkubator ungehindert erreicht.
Überprüfen Sie die Laserenergie mit einem externen Sensor. Bereiten Sie das Integrationssoftwareskript für die Pumpeninfusion vor, nachdem Sie die Strahlausrichtung bestätigt haben. 200 Millimolar Wasserstoffperoxid mit 35 Millilitern pro Minute in den ersten Brunnen einfließen lassen.
Drücken Sie die Starttaste auf der Lasersoftware an der Fünf-Sekunden-Marke, um den Impuls bei der 11-Sekunden-Markierung auf dem Timer auszulösen. 125 Millimolar Quench Lösung mit 35 Millilitern pro Minute in den ersten Brunnen unmittelbar nach dem Laserpuls einfließen lassen. Bewegen Sie die Positionierstufe manuell, um den nächsten Brunnen mit dem Laserstrahl auszurichten und den Prozess für alle Brunnen zu wiederholen.
In einer Zellkulturhaube, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen von jedem Brunnen in einzelne 15 Milliliter konische Röhren zu übertragen. Zentrifugenzellen bei 1,200 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter RIPA-Lysepuffer wieder aus.
Übertragen Sie Zellen in einzelne 1,2 Milliliter Polypropylen-Röhren. Flash einfrieren alle Proben in flüssigem Stickstoff und legen Sie sie in einem minus 80 Grad Gefrierschrank bis zum Gebrauch. Um FPOP-Modifikationen zu lokalisieren, analysieren Sie das verdaute Zelllysat mithilfe der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieanalyse und berechnen dann das Ausmaß der Modifikation.
Um zu bestätigen, dass die Bedingungen des Plattforminkubators für die Zellkultur auf der Laserplattform ausreichen, wurde GCaMP2 vorübergehend in HEK293T transfiziert und die Transfektionseffizienz für beide Platten mittels Fluoreszenzbildgebung bewertet. Ein Luziferase-Assay wurde durchgeführt, um die Transfektionseffizienz zu quantitieren. FPOP-Modifikationen in HEK293T-Zellen, die im Strömungssystem beschriftet sind, wurden mit denen verglichen, die im Plattform-Inkubator gekennzeichnet sind.
Der Plattform-Inkubator übertraf das Strömungssystem sowohl in der Anzahl der modifizierten Proteine als auch in der gesamten FPOP-Abdeckung in diesen Proteinen. Im Strömungssystem wurden zwei modifizierte Peptide nachgewiesen, die nur begrenzte strukturelle Informationen lieferten. Im Plattform-Inkubator wurden jedoch fünf modifizierte Peptide nachgewiesen, die die Aktinsequenz überspannten.
Tandem-MS-Spektren von Actin mit modifiziertem Prolin in beiden Systemen und unverändertem Aktinpeptid sind hier gezeigt. Die FPOP-modifizierten Rückstände in den Plattform-Inkubatorproben enthielten 12 modifizierte Rückstände, drei modifizierte Rückstände im Strömungssystem und einen überlappenden modifizierten Rückstand. Die LC-MS MS-Analyse ergab, dass 792 Proteine durch in vivo FPOP im Plattform-Inkubator im Vergleich zu den 545 Proteinen modifiziert wurden, die mit dem Durchflusssystem modifiziert wurden.
Es ist zwingend notwendig, Zellen unter sterilen Bedingungen zu halten. Bringen Sie den Plattform-Inkubator immer in die sterile Zellkulturhaube, um alle notwendigen Sechs-Brunnen-Platten, Schläuche und Ringe einzufügen. Dadurch wird die Integrität des Experiments sichergestellt.
