العائد العالي ونوعية الخلايا من الأنسجة المعقدة ضرورية للتحليل التجريبي شائع الاستخدام، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة وثقافات الخلايا الجذعية الأولية. يولد هذا البروتوكول خلايا صحية ذات غلة عالية وجودة عالية من مناطق مختلفة ومقصورات أنسجة لسان الثدييات ، بما في ذلك ظهارة اللسان والأنسجة الضامة. لفصل الظهارة من mesenchyme لسان الماوس E 12.5 ، نقل الماوس الأنثوي الحامل القتل الرحيم إلى المنطقة الجراحية ورطب بطن الماوس مع 70 ٪ الإيثانول لمنع الفراء من الدخول إلى موقع التشغيل.
افتح البطن باستخدام مقص تشريحي لكشف قرون الرحم التي تحمل الأجنة وتشريح قرون الرحم ونقلها إلى 15 ملليلتر من محلول تايرود الطازج في طبق ثقافة 100 ملليمتر. تحت المجهر تشريح، استخدم مقص صغير والمملقط الدقيق لتشريح الأجنة من قرون الرحم. فتح تجويف الفم مع ملقط غرامة وتشريح اللسان من الفك السفلي باستخدام مقص صغير.
غسل الألسنة مع 15 ملليلتر من محلول تايرود العقيم الطازج في طبق ثقافة 100 ملليمتر. ثم نقل الأنسجة إلى اثنين من ملليلتر من خليط انزيم من ديسباس والكولاجين في طبق ثقافة 35 ملليمتر واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. نقل الألسنة إلى 15 ملليلتر من محلول تايرود العقيم الطازج وفصل بلطف mesenchyme والظهارة من الجانب البطني باستخدام ملقط ناعم.
غسل الظهارة المنفصلة وmesenchyme مرتين في 15 ملليلتر من محلول تايرود العقيم الطازج. لفصل ظهارة اللسان عن النسيج الضام الأساسي للفأر البالغ ، قم بنقل الماوس القتل الرحيم إلى المنطقة الجراحية وترطيب رأس الماوس باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ لمنع الفراء من الدخول إلى تجويف الفم. استخدام مقص تشريح لقطع زوايا الفم على طول الخد لفتح تجويف الفم.
تشريح اللسان مع الفك السفلي، وغسله ووضعه في طبق من البلاستيك مع طبقة من البلاستيك التفاف. باستخدام ملقط جراحي لعقد اللسان، وحقن خليط انزيم من ديسباس والكولاجيناز في الفضاء تحت الإبط من اللسان من خلال حافة القطع من اللسان الخلفي. حقن ملليلتر واحد من خليط الانزيم بالتساوي إلى اللسان كله لجمع الأنسجة، ثم حقن 0.5 ملليلتر من خليط الانزيم محليا إلى اللسان الأمامي لجمع الأنسجة من طرف اللسان أو إلى اللسان الخلفي لجمع أنسجة الحليمة المحيطة.
لف اللسان بغلاف بلاستيكي واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام مقص صغير لتشريح الحليمة المحيطة وطرف اللسان. ثم نقل الأنسجة إلى 15 ملليلتر من محلول تايرود العقيم الطازج.
فصل الظهارة من النسيج الضام الكامنة في الفضاء هضم الانزيم تحت الإبط باستخدام مقص صغير وتقليم الأنسجة إلى الحجم المناسب، وفقا لمتطلبات التجارب المصب. اغسل الظهارة المنفصلة والأنسجة الضامة الأساسية مرتين في 15 ملليلتر من محلول تايرود العقيم الطازج في طبق ثقافة 100 ملليمتر. نقل الأنسجة إلى ثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA في طبق ثقافة 35 ملليمتر جديدة.
احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، والتحريض بلطف الأنسجة كل خمس دقائق مع نصائح واحدة ماصة ملليلتر. إضافة 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في DMEM F12 لوقف رد الفعل ونقل المتوسطة إلى أنبوب طرد مركزي منخفض الربط خمسة ملليلتر. الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant.
إعادة إنفاق الخلايا بلطف في ثلاثة ملليلتر من DMEM F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ BSA، وتصفية الخلايا مع مصفاة خلية 70 ميكرومتر، تليها مصفاة خلية 35 ميكرومتر. الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة معظم المتوسطة، وترك 50 إلى 300 ميكرولتر كحجم النهائي لإعادة إنفاق الخلايا. في لسان الفأر الجنيني ، تظهر فجوة في الفضاء تحت الإبط بعد هضم الإنزيم المناسب.
في لسان الفأر البالغ ، يشار إلى حقن إنزيم ناجح عن طريق تورم في المناطق المحقونة ، مما يشير إلى أن الإنزيم يمكن أن يكون محتفظا به بواسطة اللسان. بعد تجميع أوراق E12.5 الألسنة الظهارية وطبقات رقيقة من mesenchyme ، أظهر عد الخلايا اليدوي أن البروتوكول أسفر عن 63917 خلية في المجموع مع صلاحية 95.2٪ من الأوراق الظهارية ، و 294 ، 333 خلية في المجموع مع قابلية البقاء بنسبة 96.3٪ من mesenchyme. عندما استخدمت 10 ألسنة الكبار في ثمانية أسابيع من العمر، أسفر البروتوكول عن 187، 333 خلية مع صلاحية 95.4٪ من الأوراق الظهارية من طرف اللسان، 544،000 خلية مع صلاحية 96.3٪ من الأوراق الظهارية من الحليمة المحيطة، و 150، 500 خلية مع قدرة على البقاء من 93٪ من الأنسجة الضامة.
بعد هذا البروتوكول، يمكن استخدام الخلايا المفككة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وثقافة الجهازية الاختبارية ثلاثية الأبعاد لتحديد خلايا السلف الاختبارية غير المعترف بها تحت الظهارة اللغوية.
